專利名稱：重組人腫瘤壞死因子及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品；具體是涉及一種新型重組腫瘤壞死因子及制備方法。
惡性腫瘤是危害人類生命的重要疾病之一?？鼓[瘤藥物的研究現(xiàn)已擴(kuò)展到細(xì)胞因子，1978年開始，應(yīng)用天然人腫瘤壞死因子(本文簡(jiǎn)稱TNF)進(jìn)行臨床抗腫瘤試驗(yàn)，證實(shí)其具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞、破壞腫瘤組織的作用。但是，它的毒副作用很大，尤其是靜脈給藥時(shí)，可引起發(fā)熱、寒顫、呼吸困難、低血壓等不良反應(yīng)。因此限制了TNF的使用劑量，抗腫瘤作用亦難以發(fā)揮。
本發(fā)明的目的在于研制抗腫瘤作用強(qiáng)，毒副作用低的新型TNF。
本發(fā)明提供了一種新型重組人腫瘤壞死因子(本文簡(jiǎn)稱rhTNF-NC)。本發(fā)明的rhTNF-NC基因含1個(gè)NdeⅠ酶切位點(diǎn)和1個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，在起始密碼子(ATG)后緊接ArgLysArg的密碼子(5＇CGCAAACGT3＇)，其后是天然hTNF11位以后的氨基酸編碼序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，但156位和Ala和157位Leu的密碼子(GCC)和(CTG)至少有一個(gè)改為Gln、Ser、Gly、Thr、Tyr、Asn的密碼子(CAG、TCG、GGG、ACG、TAC、AAC)中的一個(gè)，終止密碼子為TGA。
經(jīng)改造后所所得rhTNF-NC基因?qū)?yīng)的氨基酸序列共151個(gè)氨基酸。與天然hTNF相比，天然hTNF氨基端第1-7位氨基酸殘基缺失，第8、9、10位氨基酸置換為Arg、Lys、Arg，羧基末端Ala和Leu至少有一個(gè)置換為Gln、Ser、Gly、Thr、Tyr、Asn中的一個(gè)。
本發(fā)明的rhTNF-NC抗腫瘤藥效學(xué)及免疫試驗(yàn)結(jié)果如下一、主要試驗(yàn)方法1．體外試驗(yàn)用細(xì)胞毒法。按公式求出各濃度組的抑制率，通過各濃度的抑制率求直線回歸方程，算出IC50值。
抑制率=(1-受試孔OD值/對(duì)照組OD值)×100％2．體內(nèi)試驗(yàn)2.1．皮下接種實(shí)體瘤試驗(yàn)。按公式計(jì)算腫瘤抑制率，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。
腫瘤抑制率％=(1-試驗(yàn)組瘤重/對(duì)照組瘤重)×100％2.2．腹水型腫瘤延長(zhǎng)生命試驗(yàn)。按公式計(jì)算延長(zhǎng)率，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。
生命延長(zhǎng)率％=(試驗(yàn)組動(dòng)物平均生存天數(shù)/對(duì)照組動(dòng)物平均生存天數(shù))×100％2.3．實(shí)體腫瘤瘤內(nèi)給藥的出血壞死試驗(yàn)取生長(zhǎng)旺盛的肉瘤S-180勻漿法制備成約1-2×107/ml細(xì)胞懸液，接腫于昆明種小鼠右腋下，次日隨機(jī)分組，在接種后8天分別it及iv給藥一次，給藥后24小時(shí)解剖腫瘤，各組腫瘤標(biāo)本的出血性壞死程度參照Carswell的標(biāo)準(zhǔn)判斷。2.4．實(shí)體瘤內(nèi)給藥試驗(yàn)取生長(zhǎng)旺盛的人體肝癌QGY勻漿法制備成約1-2×107/ml細(xì)胞懸液，接種于裸小鼠右腋皮下，待腫瘤接觸后，次日隨機(jī)分組并開始進(jìn)行瘤內(nèi)給藥，給藥結(jié)束后適當(dāng)時(shí)間進(jìn)行解剖，按前述公式計(jì)算腫瘤抑制率，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。3．免疫試驗(yàn)方法3.1．腹腔巨噬細(xì)胞(Mφ)吞噬功能試驗(yàn)3.2．荷Lewis肺癌小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定3.3．白細(xì)胞介素-1(IL-1)的檢測(cè)4．給藥方法與試驗(yàn)對(duì)照體內(nèi)試驗(yàn)采用與臨床相同的iv途徑，以iv×5qod方案。
另一途徑為ip×5qod方案。
個(gè)別腫瘤模型還以it×5qod方案。
空白對(duì)照相應(yīng)溶劑陽(yáng)性對(duì)照腹水瘤采用絲裂霉素(MMC)，實(shí)體瘤采用環(huán)磷酰胺(CTX)，原型rhTNF。二、主要結(jié)果表1 rhTNF-NCiv對(duì)C-26結(jié)腸癌的作用抑制率(％)組別劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC1.642×10840.1340.0842.86rhTNF-NC3.284×10732.6332.6329.90rhTNF-NC6.568×10625.1725.1713.95陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑0.0 0.0 0.0
表2 rhTNF-NCip對(duì)C-26結(jié)腸癌的作用抑制率(％)組別劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC1.642×10837.2935.0636.79rhTNF-NC3.284×10730.0329.1530.43rhTNF-NC6.568×10614.1917.3418.73陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 0.0 0.0 0.0表3 rhTNF-NC iv對(duì)黑色素瘤B16肺轉(zhuǎn)移的作用抑制率(％)組別劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC1.642×10849.5454.8251.08rhTNF-NC3.284×10731.6334.5338.27rhTNF-NC6.568×10610.9822.7520.96陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 0.0 0.0 0.0表4 rhTNF-NCip對(duì)黑色素瘤B16肺轉(zhuǎn)移的作用抑制率(％)組別劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC1.642×10843.0039.2938.91rhTNF-NC3.284×10732.1930.9829.18rhTNF-NC6.568×10615.0119.5216.57陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 0.0 0.0 0.0
表5 rhTNF-NC iv對(duì)荷S180肉瘤腹水型小鼠延長(zhǎng)生命的作用延長(zhǎng)率(％)組別劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC1.642×10848.8747.0643.44rhTNF-NC3.284×10739.8538.2333.61rhTNF-NC6.568×10615.7919.1218.03陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 0.0 0.0 0.0表6 rhTNF-NCip對(duì)荷S180肉瘤腹水型小鼠延長(zhǎng)生命的作用延長(zhǎng)率(％)組別劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC1.642×10854.2653.9755.74rhTNF-NC3.284×10740.3143.6537.87rhTNF-NC6.568×10629.4831.7533.62陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 0.0 0.0 0.0表7 rhTNF-NCiv對(duì)荷人體腸癌Lovo小鼠延長(zhǎng)生命的作用延長(zhǎng)率(％)組別 劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×10832.8736.9532.94rhTNF-NC 3.284×10722.3828.1424.72rhTNF-NC 6.568×10618.8816.6012.45陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑0.0 0.0 0.0
表8 rhTNF-NCip對(duì)荷人體腸癌Lovo小鼠延長(zhǎng)生命的作用延長(zhǎng)率(％)組別劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC1.642×10844.26 43.8747.00rhTNF-NC3.284×10731.15 35.4834.93rhTNF-NC6.568×10618.03 23.6519.97陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 0.0 0.0 0.0表9 rhTNF-NC與rhTNFit對(duì)人體肝癌(QGY)的作用比較延長(zhǎng)率(％)組別 劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC 1.642×10879.09 83.5579.95rhTNF-NC 3.284×10768.03 71.8570.34rhTNF-NC 6.568×10652.38 55.0457.69rhTNF2.286×10555.41 55.0460.10陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑0.0 0.0 0.0表10 rhTNF-NC與rhTNFiv對(duì)人體肝癌(QGY)的作用比較抑制率(％)組別劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC1.642×10840.0042.5337.75rhTNF-NC3.284×10730.5933.6430.39rhTNF-NC6.568×10617.6515.8915.20rhTNF 2.286×10521.5718.2219.12陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 0.0 0.0 0.0
表11 rhTNF-NC與rhTNFip對(duì)S180實(shí)體瘤的作用比較抑制率(％)組別劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC1.642×10850.9142.8645.12rhTNF-NC3.284×10742.1835.7135.69rhTNF-NC6.568×10625.097.10914.48rhTNF 2.286×10528.3613.2119.53rhTNF 4.572×10416.3613.2117.51rhTNF 9.144×10312.368.9 21.55陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 0.0 0.0 0.0表12 rhTNF-NC與rhTNFiv對(duì)S180實(shí)體瘤的作用比較抑制率(％)組別劑量(u/M2)(1) (2) (3)rhTNF-NC1.642×10857.9750.0752.51rhTNF-NC3.284×10742.4242.8545.15rhTNF-NC6.568×10620.0614.2823.08rhTNF 2.286×10522.0414.2831.10rhTNF 4.572×10413.4910.7117.06rhTNF 9.144×10317.4310.7114.72陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 0.0 0.0 0.0表13 rhTNF-NC對(duì)昆明種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性的作用組別劑量(u/M2) 吞噬指數(shù)(X±SD)(1) (2)rhTNF-NC3.284×1070.913±0.146***0.574±0.108***rhTNF-NC6.568×1060.892±0.164***0.596±0.074***陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 0.437±0.122 0.258±0.061***P＜0.01表14 rhTNF-NC對(duì)荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性的影響CPM值(X±SD)組別劑量(u/M2)(1) (2)rhTNF-NC1.642×1085166±680**4735±1123*rhTNF-NC3.284×1074846±734**4100±523**rhTNF-NC6.568×1064529±749**3874±984**陰性對(duì)照相應(yīng)溶劑 6287±1670 5447±1361**P＜0.01,*P＜0.05表15 rhTNF-NC對(duì)體外培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞誘生分泌IL-1的作用組別 劑量 最大反應(yīng)百分率(μg/ml) 1∶64 1∶321∶16 1∶81∶4rhTNF-NC 1 6.99 11.9723.56 50.23 10011.45 13.2035.25 50.87 100rhTNF-NC 0.16.92 8.70 10.81 12.83 15.8611.18 10.9315.43 12.86 20.25LPS 6.20 8.60 7.0 7.587.839.90 15.6111.77 13.86 10.26表16 rhTNF-NC對(duì)各種腫瘤細(xì)胞株的體外抑制作用細(xì)胞株樣品 IC50(pmol/ml)(1) (2) (3)L929 rhTNF 0.4420.382 0.46rhTNF-NC 0.0420.039 0.048CNE-2 rhTNF 1.8681.648 1.548rhTNF-NC 0.1920.159 0.162RCC94616 rhTNF 1.5811.850 1.643rhTNF-NC 0.1660.190 0.139A59 rhTNF 2.3251.652 1.766rhTNF-NC 0.1960.140 0.149三、試驗(yàn)結(jié)論1、新型重組人腫瘤壞死因子-NC(rhTNF-NC)體外試驗(yàn)對(duì)人體腫瘤細(xì)胞株；成纖維細(xì)胞系L929、鼻咽癌細(xì)胞CNE-2、腎透明細(xì)胞癌RCC94616以及肺癌細(xì)胞A59均有明顯的抑制作用。
rhTNF-NC對(duì)各種細(xì)胞株的抑制效果明顯高于原型rhTNF。2、體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)對(duì)小鼠結(jié)腸癌C-26、小鼠黑色素瘤B-16實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移、人體腸癌Lovo、人體肝癌QGY、小鼠肉瘤S180腹水型及肉瘤S180實(shí)體，均顯示出一定的抑瘤或延長(zhǎng)生命的效果，尤其對(duì)QGY瘤內(nèi)注射效果更為明顯，實(shí)驗(yàn)重視性好，且有一定的量效關(guān)系與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類同。
對(duì)S180肉瘤內(nèi)iv或it一次注射結(jié)果顯示其有一定的出血壞死作用。3、rhTNF-NC與原型rhTNF比較(等毒劑量)對(duì)S180實(shí)體瘤進(jìn)行了療效比較試驗(yàn)，結(jié)果rhTNF各劑量組均未見明顯的抑瘤作用；it也表明rhTNF-NC抑瘤作用比rhTNF強(qiáng)的多。4、rhTNF-NC對(duì)昆明種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞有明顯提高吞噬活性；對(duì)荷Lewis肺癌小鼠的NK細(xì)胞活性也有較明顯的提高。以及對(duì)體外培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-1具有明顯的誘生作用。
本發(fā)明的rhTNF-NC的藥理學(xué)研究結(jié)果如下(一)對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響實(shí)驗(yàn)方法采用1.25×107u/m2(小劑量組)和2.50×107u/m2(大劑量組)，分別相當(dāng)于文獻(xiàn)報(bào)道推薦臨床劑量的20和40倍，生理鹽水組0.1ml/10g，分別觀察記錄給藥前、給藥后10、20、30、60、90及120min的小鼠自發(fā)活動(dòng)情況。記錄給藥前、給藥后30、60、120及180min的小鼠爬桿活動(dòng)狀況，并連續(xù)給藥一周后再觀察記錄一次。
結(jié)果表明rhTNF-NC對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)影響。(二)對(duì)大鼠心血管系統(tǒng)的影響實(shí)驗(yàn)方法采用6.25×106u/m2和1.25×107u/m2，分別相當(dāng)于文獻(xiàn)報(bào)道推薦臨床劑量的10和20倍，生理鹽水組0.2ml/100g。分別觀察記錄給藥前、給藥后10、20、30、60、90及120min的大鼠心率、心律、ECG之T波、QRS時(shí)間、ST段、收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓。
結(jié)果表明無(wú)論是給藥組之間，給藥組與生理鹽水對(duì)照組之間，以及各組給藥前后比較，均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。表明ivrhTNF-NC對(duì)循環(huán)系統(tǒng)無(wú)明顯影響。(三)對(duì)大鼠呼吸系統(tǒng)的影響實(shí)驗(yàn)方法采用6.25×106u/m2和1.25×107u/m2，分別相當(dāng)于文獻(xiàn)報(bào)道推薦臨床劑量的10和20倍，生理鹽水組0.2ml/100g，分別觀察記錄給藥前、給藥后10、20、30、60、90及120min的大鼠呼吸頻率、節(jié)律和深度。
結(jié)果表明無(wú)論是給藥組之間，給藥組與生理鹽水對(duì)照組之間、以及各組給藥前后比較，均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。表明ivrhTNF-NC對(duì)呼吸系統(tǒng)無(wú)明顯影響。
本發(fā)明的rhTNF-NC的毒理學(xué)研究結(jié)果如下；一、rhTNF-NC急性毒性試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)觀察了iv、im及iprhTNF-NC對(duì)小鼠的急性毒性，得出了相應(yīng)的LD50和MTD；觀察了iv和iprhTNF-NC對(duì)大鼠的急性毒性，得出了相應(yīng)的LD50和MTD。小鼠ivLD507.77×108u/m2小鼠im MTD＞3.90×108u/m2小鼠ip MTD＞1.25×109u/m2大鼠iv LD50＞1.25×109u/m2大鼠ip MTD＞1.25×109u/m2實(shí)驗(yàn)結(jié)果體重和食量等8項(xiàng)生理指標(biāo)無(wú)明顯改變。二、rhTNF-NCiv對(duì)猴的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法恒河猴隨機(jī)分為正常對(duì)照組，原型rhTNF對(duì)照組rhTNF-NC小劑量組和大劑量組每組4只。大、小劑量組給藥量分別為9.3×107U/m2和9.3×106U/m2，分別相當(dāng)于文獻(xiàn)報(bào)道推薦臨床劑量的150倍和15倍。原型對(duì)照組劑量為6.2×107U/m2，相當(dāng)于文獻(xiàn)報(bào)道推薦臨床劑量的100倍。iv連續(xù)給藥30天，rhTNF對(duì)照組給藥10天。停藥后24h宰殺一半作病檢，另一半繼續(xù)觀察15天后宰殺病檢。
觀察指標(biāo)癥狀觀察動(dòng)物的體重、肛溫、呼吸、心率、食量、嘔吐、流涎、尿、糞便、步態(tài)、行為、精神、活動(dòng)、呼喚反應(yīng)、瞳孔大小、對(duì)光反射等共16項(xiàng)。體溫、肛溫、瞳孔、呼吸和心率給藥前測(cè)2次，給藥后每半月測(cè)1次，其余項(xiàng)目從給藥前1周起每天觀察1次。
ECG按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，猴取自然站立位，描記肢體Ⅱ?qū)?lián)。
血液學(xué)用美國(guó)產(chǎn)CD-610型全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀測(cè)定。
血液生化靜脈取血，分離血清，用意大利產(chǎn)UnifastⅡ型血?jiǎng)由治鰞x測(cè)定。
尿液分析用廣州東方化學(xué)應(yīng)用研究所產(chǎn)的八聯(lián)試紙測(cè)定。
以上ECG、血液學(xué)、血液生化和尿液分析，分別于給藥前(d0)給藥期間(d15、d30，原型組為d7,d10)及停藥后(d45，原型組為d25)檢測(cè)。d0間隔一周測(cè)2次取均值，余各測(cè)1次。
病理檢查末次給藥后24hriv戊巴比妥鈉麻醉，用頸總動(dòng)脈放血及氣管切斷法宰殺一半動(dòng)物，另一半觀察15天后同法宰殺病檢。對(duì)心、肝、脾、肺、腎、腦、腎上腺、胸腺、甲狀腺、前列腺、睪丸及附睪、子宮及卵巢12個(gè)臟器稱重，并分別計(jì)算各臟器的相對(duì)重量。組織光鏡觀察有心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、十二指腸、回腸、結(jié)腸、垂體、甲狀腺、腎上腺、胸腺、胰腺、腸系膜淋巴結(jié)、前列腺、膀胱、睪丸及附睪或卵巢及子宮、視神經(jīng)、注射局部靜脈等共24項(xiàng)。
骨髓檢查于宰殺的同時(shí)在股骨取材，涂片，染色，鏡檢。
抗血清效價(jià)測(cè)定(ELISA法)于d15、d30、d45分別測(cè)rhTNF-NC抗血清效價(jià)，原型組于d10、d15和d25分別測(cè)rhTNF抗血清效價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果臨床癥狀實(shí)驗(yàn)過程中，正常組猴進(jìn)食正常，能吃完所有喂的食物，小劑量組也能基本吃完。但速度比正常組稍慢，大劑量組則食欲大減，僅能吃少量食物，原型對(duì)照則不吃或僅吃極少。此外，正常組猴生長(zhǎng)良好，皮毛均勻有光澤，活潑好動(dòng)，呼吸反應(yīng)靈敏，瞳孔大小正常，對(duì)光反射良好，無(wú)嘔吐、流涎。而給藥組尤其是大劑量組和原型對(duì)照組除納差外，活動(dòng)明顯減少，毛發(fā)疏松無(wú)光澤，原型對(duì)照組尤其甚，精神萎靡，佝背或倚籠坐臥。
血液學(xué)指標(biāo)RBC、Hb、Hct、MCV、MCH、WBC及分類，凝血時(shí)間和血小板的變化與正常對(duì)照組相比，在停藥時(shí)原型rhTNF對(duì)照組的RBC、Hb及Hct均顯著低于正常對(duì)照組見表17。因此可認(rèn)為rhTNF可導(dǎo)致猴貧血。此外大劑量組在d15時(shí)MCV和MCH均顯著大于正常對(duì)照組，但仍在正常范圍內(nèi)。
表17 rhTNF-NCiv猴長(zhǎng)期毒性血液學(xué)變化停藥時(shí)組別 RBC Hb Hct正常5.65±0.93 120±8 0.327±0.038小劑量 5.81±0.4128±11 0.349±0.026大劑量 4.73±0.9109±5 0.270±0.048原型4.20±0.5*107±6*0.245±0.039**P＜0.05血液生化指標(biāo)ALT、AST、ALP、TP、Alb、BUN、Crea、Tch、TBill及Glu的變化在給藥組之間，給藥組與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的明顯差異。但從人體上來(lái)看，原型對(duì)照組公5號(hào)和母11號(hào)動(dòng)物在瀕死前AST、BUN和Crea均非常顯著地升高，顯示了肝臟和腎臟受損見表18。
表18 rhTNF-NCiv猴長(zhǎng)期毒性血液生化變化停藥時(shí)組別AST BUNCrea正常 312±56 4.9±1.023±11小劑量329±181 4.2±0.865±8大劑量227±141 4.6±0.971±13原型5號(hào) 982 18.38 12611號(hào) 1050 12.43 101上述試驗(yàn)中，rhTNF-NCiv猴，劑量分別為9.3×107U/m2和9.3×106U/m2，分別相當(dāng)于推薦臨床劑量的150倍和15倍(rhTNF-NCiv成人常用量為6.2×105U/m2)，連續(xù)30d，經(jīng)生化指標(biāo)共30項(xiàng)、病理檢查共24項(xiàng)檢測(cè)，未見嚴(yán)重的藥物性毒性反應(yīng)。與此相對(duì)照，rhTNFiv猴，劑量為6.2×107U/m2(相當(dāng)于推薦臨床劑量的100倍)見產(chǎn)生了較為明顯的肝臟和腎臟毒性，引起紅系降低，導(dǎo)致注射局部靜脈炎及血栓形成等，并在給藥后10天內(nèi)出現(xiàn)了一半動(dòng)物死亡，說(shuō)明同等活性的rhTNF-NC比rhTNF的毒性低得多，其應(yīng)用于臨床將會(huì)有更大的安全性。
本發(fā)明的rhTNF-NC的特殊毒性試驗(yàn)(一)致突變?cè)囼?yàn)1、Ames試驗(yàn)rhTNF-NC對(duì)鼠傷寒沙門氏菌四株標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株TA97、TA98、TA100和TA102的回復(fù)突變作用，結(jié)果表明，在0.1-500μg/皿(2×104-108μ/皿)劑量范圍內(nèi)，無(wú)論是否加入S9活化系統(tǒng)，rhTNF-NC均不引起四株測(cè)試菌株回復(fù)突變率增高，無(wú)致突變性。2、對(duì)CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)rhTNF-NC濃度為37.5、70.0、150.0和300.0μg/ml時(shí)分別與CHL細(xì)胞接觸培養(yǎng)(包括加S9)，24和48h收獲細(xì)胞，結(jié)果染色體畸變率在正常范圍(1.5-5.5％)。3、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)rhTNF-NC2.66、1.33、0.67、0.07μg/kg(1.744×106、0.872×106、0.436×106、0.436×105u/m2)四個(gè)劑量SC后12、24、36、48、72hr后取材，其它各組分別于給藥后24hr取材制片，觀察嗜多染色細(xì)胞的微核率，結(jié)果給藥組微核細(xì)胞率為0.33-2.00，溶劑為1.50，無(wú)顯著差異，陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)磷胺為36％。表明在本實(shí)驗(yàn)劑量下，rhTNF-NC對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率無(wú)明顯影響。(二)對(duì)小鼠敏感期致畸試驗(yàn)rhTNF-NC0.1、0.6、3.6μg/kg(0.65×105、0.39×106、2.34×106u/m2)三個(gè)劑量，相當(dāng)于文獻(xiàn)報(bào)道臨床劑量的3、18和108倍，于小鼠妊娠第6-15天連續(xù)SC，每天一次，未發(fā)現(xiàn)明顯的胚胎毒性及致畸胎作用，與溶劑對(duì)照組相比無(wú)顯著差別。表明在此劑量范圍內(nèi)，rhTNF-NC對(duì)小鼠無(wú)胚胎毒性和致畸胎作用。
本發(fā)明的另一目的是提供了新型重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-NC)的制備方法，該方法包括以下步驟1、工程菌培養(yǎng)和發(fā)酵工藝在生長(zhǎng)有生產(chǎn)菌種菌落的LB(Amp)平板上，挑取單菌落接種進(jìn)5mlLB培養(yǎng)液中30℃培養(yǎng)12小時(shí)。取2ml轉(zhuǎn)接入200mlLB培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)3小時(shí)至OD6000.4左右，以1％比例轉(zhuǎn)接入10L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為TH培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)3小時(shí)至OD6000.4左右，在15min內(nèi)使培養(yǎng)溫度升高至42℃繼續(xù)培養(yǎng)2-5小時(shí)。發(fā)酵過程中PH控制在6.8-7.0之間，溶氧控制在30％以上；2、菌體回收發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管，4℃,4000g離心15分鐘，棄上清液，用冰冷的TSE溶液(0.1M Tris,0.2M NaCl,0.05MEDTA,pH7.2)洗滌菌體兩次，得菌體50g左右?；厥盏木w若不進(jìn)行裂解，則凍于-20℃保存；3、菌體裂解采用超聲破碎法，每10克濕菌加TSE100ml，用300W功率進(jìn)行超聲，超聲30秒，停30秒，共超聲20分鐘。。然后將超聲破碎液離心(4℃,12,000g,10分鐘)，取菌體裂解液上清(約50ml)倒入干凈的三角燒瓶?jī)?nèi)，用于進(jìn)一步純化；4、鹽析與透析用硫酸銨對(duì)菌體裂解液上清進(jìn)行分級(jí)鹽析。將裝有500ml菌體裂解液上清的三角燒瓶置于冷柜中的磁力攪拌器上，緩慢加入固體硫酸銨，邊加邊攪，至硫酸銨達(dá)40％飽和度，然后靜置1小時(shí)。將上述鹽析物離心(4℃,12,000g,15分鐘)，上清倒入一干凈的三角燒瓶?jī)?nèi)，邊加邊攪，至硫酸銨達(dá)60％飽和度。4℃，靜置1小時(shí)。將鹽析物離心(4℃,12,000g,15分鐘)。棄掉上清，得沉淀約15g左右。沉淀用溶液Ⅰ(19mM Tris.Cl,PH7.2)溶解(每克沉淀加入10ml溶液Ⅰ)，然后裝入4個(gè)2×15cm的透析袋中，對(duì)10倍體積溶液Ⅰ透析72小時(shí)，每隔12小時(shí)換透析液一次；5、離子交換層析將已經(jīng)處理好的Pharmacia DEAE-Aepharose CL-6B裝柱(5×15cm)，置冷柜中，用溶液Ⅰ平衡12小時(shí)，流速為3.5ml/min。將透析好的樣品上樣于平衡好的DEAE-Aepharose CL-6B柱上，進(jìn)行層析，流速為3.5ml/min。先用流動(dòng)相Ⅰ洗脫至洗脫曲線回基線，然后換用流動(dòng)相Ⅱ(20mM Tris-Cl,150mM NaCl,PH7.0-9.0)洗脫，可見兩個(gè)洗脫峰，收集洗脫液峰Ⅱ。樣品收集完畢后，用流動(dòng)相Ⅲ(20mMTris-Cl,1000mM NaCl,PH7.0-9.0)清洗層析柱；6、分子篩層析將處理好的Sephacryl S-200填料裝柱(6.2×140cm)，置冰柜中，用溶液Ⅰ平衡12小時(shí)，流速5ml/min。將經(jīng)DEAE-SepharoseCL-6B柱層析洗脫樣品進(jìn)行超濾濃縮(超濾膜的截留分子量為10KD)至100ml左右。上樣平衡好的Sephacryl S-200柱，進(jìn)行層析。洗脫液為溶液Ⅰ，流速5ml/min。收集洗脫峰Ⅱ；7、制劑與凍干將Sephacryl S-200柱層析樣品峰留樣待檢，其余立即加入人白蛋白保護(hù)劑至最終含量1％。測(cè)定樣品生物活性，根據(jù)活性測(cè)定結(jié)果，用磷酸緩沖液(20mM PB,PH7.0,0.48M NaCl)稀釋到50萬(wàn)單位/0.5ml的濃度，補(bǔ)加入白蛋白，至最終含量1％。然后用0.22um孔徑濾膜除菌，抽樣進(jìn)行生物活性測(cè)定、熱原質(zhì)試驗(yàn)和無(wú)菌試驗(yàn)。此三項(xiàng)檢測(cè)合格者進(jìn)行分裝，每支安瓿分裝0.5ml，內(nèi)含不少于rhTNF-NC 50萬(wàn)單位。冷凍干燥后，熔封。
用本發(fā)明方法制備的rhTNF-NC的鑒別和測(cè)定結(jié)果如下1、分子量測(cè)定結(jié)果測(cè)量的分子量在17.2-17.9KD之間。2、免疫印跡鑒定實(shí)驗(yàn)方法(1)樣品同時(shí)進(jìn)行兩塊SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，一塊做銀染，另一塊做免疫印跡檢定。
(2)安裝轉(zhuǎn)移裝置。切6張濾紙及1張硝酸纖維素膜，其大小與凝膠大小一致將硝酸纖維素膜漂于蒸餾水中，使之濕潤(rùn)并浸泡5分鐘；將切好的濾紙浸泡于少量轉(zhuǎn)移緩沖液(Tris,2.42g，甘氨酸11.2g，甲醇200ml，加水至1000ml)中。將其中3張濾紙置于石墨電極上，排除氣泡，再將硝酸纖維素膜置于濾紙上，對(duì)齊，排除氣泡，然后取下凝膠，用蒸餾水漂洗一下，平放于硝酸纖維素膜上，最后將另3張濾紙放于凝膠上，對(duì)齊，排除氣泡。
(3)將另一塊石墨電極置于濾紙上，接上電源，按0.65mA/cm2接通電流，電轉(zhuǎn)移2小時(shí)。
(4)將硝酸纖維素膜裝入雜交袋，加入5ml封阻液(用PBS配成的1％無(wú)脂速溶奶粉)，排氣泡，封口，室溫下溫和振搖1小時(shí)。
結(jié)果rhTNF-NC均與TNF抗血清起免疫反應(yīng)。3、紫外光譜掃描實(shí)驗(yàn)方法半成品原液用雙蒸水稀釋至280nm的吸收度值為0.5左右，進(jìn)行紫外光譜掃描。掃描范圍為200-300nm，掃描速度為750nm/min。使用儀器為Beckman DU-68型紫外分光光度計(jì)。
結(jié)果rhTNF-NC特征吸收波長(zhǎng)為279.0nm。4、肽圖測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法(1)酶解條件樣品凍干后溶于PH8.5的0.1N NH4HCO3，加入TPCK-Trypsin(樣品∶酶=20∶1w/w),37℃保溫20小時(shí)后進(jìn)行HPLC分析。
(2)色譜分析條件HP 1090HPLC儀柱ABI RP-300(30×2.1mmI.D.)0.1％TFA-0.08％TFA/ACN，梯度洗脫(0-90min,0-70％B),40℃,215nm檢出流速0.2ml/min結(jié)果圖譜一致5、N-末端氨基酸序列分析實(shí)驗(yàn)方法分析儀器使用BECKMAN LF3200蛋白/多肽氨基酸序列測(cè)定儀。按中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所植物分子遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蛋白/多肽氨基酸序列測(cè)定分析方法進(jìn)行。
結(jié)果N端20個(gè)氨基酸的序列為Met Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His ValVal Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu6、等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果三批rhTNF-NC等電聚焦電泳圖譜一致，主區(qū)帶均在PH6.0-6.5之間。7、純度測(cè)定SDS-PAGE電泳純度測(cè)定結(jié)果rhTNF-NC純度在97％以上。
HPLC純度測(cè)定結(jié)果rhTNF-NC純度大于95％。
本發(fā)明的rhTNF-NC是新型重組的腫瘤壞死因子，至今未見文獻(xiàn)報(bào)道。該產(chǎn)品的抗腫瘤療效優(yōu)于原型TNF，毒副作用小，無(wú)致畸、致突變作用。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)便，宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
實(shí)例一、PCR法合成rhTNF-NC基因1、PCR模板rhTNF-NC的基因通過PCR擴(kuò)增得到。PCR的模板為天然人腫瘤壞死因子(hTNF)的cDNA。
2、PCR引物設(shè)計(jì)(1)PCR引物1(plus)5’GC CAT ATG CGC AAA CGT AAG CCT GTA GCC CATGTT GTA GCA AAC CCT CA 3’(2)PCR引物2(minus)5’CCGGAATTCTCACTGGGCAATGATCCCAAAGTA3’(3)PCR引物序列(黑體書寫)與模板序列對(duì)比及基因突變理論結(jié)果Met Arg Lys Arg5’ GCCATATG CGC AAA CGTAAG CCT GTA GCCGTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCCVal Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val AlaCAT GTT GTA GCA AAC CCT CACAY GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGGHis Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln TrpCTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAGLeu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val GluCTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TACLeu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu TyrCTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCCLeu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys ProTCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCCSer Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile AlaGTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAGVal Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile LysAGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAGSer Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala LysCCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTGPro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln LeuGAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GACGlu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro AspTAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATCTyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly IleIle Ala Leu ↓ATT GCC CTG TGATAA CGG GTC ACT CTTAAGGCC 5’CAGGln3、PCR引物合成PCR引物合成由中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所DNA合成室進(jìn)行，PAGE純。
4、PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR擴(kuò)增在Perkin-Elmer 4800型擴(kuò)增儀上進(jìn)行。采用復(fù)旦大學(xué)提供的商品化FDDK-ⅡDNA擴(kuò)增試劑盒。循環(huán)溫度為94℃中作用5分鐘。PCR擴(kuò)增結(jié)果見

圖1。
圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果1．DNA Marker(φx174DNA+HaeⅢ)2．?dāng)U增產(chǎn)物實(shí)例二、rhTNF-NC基因DNA序列分析PCR擴(kuò)增片段經(jīng)T4聚合酶削平后，再用EcoRⅠ酶切，將該片段亞克隆至pUC118和pUC119質(zhì)粒的Smal和EcoRⅠ位點(diǎn)之間，構(gòu)建成pUC118-hTNF-NC和pUC119-hTNF-NC，分別轉(zhuǎn)化MV1184宿主菌，制備單鏈。兩條單位鏈一條為rhTNT-NC的編碼鏈，另一條為其互補(bǔ)鏈，分別測(cè)定這兩條單鏈的序列。DNA序列測(cè)定由中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所植物分子遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室BECKMAN生物技術(shù)示范實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，PCR合成的rhTNF-NC基因序列與理論設(shè)計(jì)完全一致。
圖2．克隆的PCR擴(kuò)增片段的序列測(cè)定A編碼鏈B互補(bǔ)鏈實(shí)例三、表達(dá)質(zhì)粒pJLA-hTNFNC的構(gòu)建1、表達(dá)載體表達(dá)載體為pJLA503，大小4.9kb，含PRPL雙啟動(dòng)子均受溫度敏感的cI857基因產(chǎn)物所調(diào)控。具體結(jié)構(gòu)見圖3。
圖3表達(dá)載體pJLA503的物理圖譜2、rhTNF-NC表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程用NdeⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切pUCll8-hTNFNC質(zhì)粒，切出rhTNF-NC的基因片段，用低融點(diǎn)瓊脂糖法回收，插入用NdeⅠ和EcoRⅠ切開的pJLA503中，T4DNA連接酶連接，形成的rhTNF-NC表達(dá)質(zhì)稱為pJL-hTNFNC。
3、pJLA-hTNFNC的酶切鑒定采用CaCl2方法制備宿主菌HB101的感受態(tài)，并用上述連接好的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用堿裂解法抽pJLA-hTNFNC，然后用NdeⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見兩個(gè)條帶，大小分別為0.5kb和4.9kb左右，見圖4。
圖4 pJLA-hTNFNC的酶切鑒定實(shí)例四、rhTNF-NC工程菌1、rhTNF-NC工程菌的構(gòu)建及表達(dá)鑒定采用CaCl2方法制備主菌HMS174基因型為recAl hsdR rif的感受態(tài)，用pJLA-hTNFNC進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過篩選獲得表達(dá)rhTNF-NC的工程菌株。具體制備步驟如下1)從于37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)的HMS174新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L燒瓶中，于37℃搖振培養(yǎng)約3小時(shí)；2)在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌的、用冰預(yù)冷的50ml離心管中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0℃；3)于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細(xì)胞；4)倒出培養(yǎng)液，以10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸沉淀，放置于冰上30分鐘；5)于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以收回細(xì)胞；6)倒出培養(yǎng)液，用2ml冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸細(xì)胞沉淀，即為HMS174感受態(tài)細(xì)胞；7)取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，加入pJLA-hTNFNC質(zhì)粒DNA(體積＜10μl,DNA＜50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，在冰中放置30分鐘；8)將它放入42℃水溶90秒，不要搖動(dòng)?？焖賹⒐芊湃氡≈校辜?xì)胞冷卻1-2分鐘；9)每管加入800μl 37℃的LB培養(yǎng)液，在37℃搖床上，溫浴45分鐘；10)將適當(dāng)體積的已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂到LB瓊脂平板上；11)將平板倒置，于37℃培養(yǎng)，12-16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。
rhTNF-NC工程菌單菌落接種含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基(LB(Amp))中，在30℃生長(zhǎng)過夜，次日，按2％比例轉(zhuǎn)接入LB(Amp)培養(yǎng)中，30℃培養(yǎng)3小時(shí)，然后升溫至42℃繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，離心回收菌體，用菌體進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，rhTNF-NC在宿主菌大腸桿菌HMS174菌種中的表達(dá)情況如圖5。
圖5 rhTNF-NC工程菌熱誘導(dǎo)表達(dá)前后菌體的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜1．標(biāo)準(zhǔn)分子量；2．rhTNF-NC工程菌誘導(dǎo)前；3．rhTNF-NC工程菌誘導(dǎo)后；4．未含表達(dá)質(zhì)粒宿主菌誘導(dǎo)前；5．未含表達(dá)質(zhì)粒宿主菌誘導(dǎo)后。
SDS-PAGE凝膠用薄層掃描，結(jié)果表明，rhTNF-NC在大腸桿菌HMS174菌株中高效表達(dá)，表達(dá)量為全菌總蛋白的32.3％。該工程菌(HMS174(pJLA-hTNFNC))的rhTNF-NC的表達(dá)水平較高，具有產(chǎn)業(yè)化開發(fā)價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種新型重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-NC)，基特征在于它含有1個(gè)NdeⅠ酶切位點(diǎn)和1個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，在起始密碼子(ATG)后緊接ArgLysArg的密碼子(5＇CGCAAACGT3＇)，其后是天然hTNF11位以后的氨基酸編碼序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，但156位和Ala和157位Leu的密碼子(GCC)和(CTG)至少有一個(gè)改為Gln、Ser、Gly、Thr、Tyr、Asn的密碼子(CAG、TCG、GGG、ACG、TAC、AAC)中的一個(gè)，終止密碼子為TGA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種新型重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-NC)，其特征在于它所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列共有151個(gè)氨基酸，并且與原型人腫瘤壞死因子(TNF)相比，氨基端第1-7位氨基酸殘基缺失，第8、9、10位氨基酸置換為Arg、Lys、Arg，羧基未端Ala和Leu至少有一個(gè)置換為Gln、Ser、Gly、Thr、Tyr、Asn中的一個(gè)。
3.一種如權(quán)利要求1所述的一種新型重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-NC)的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)工程菌培養(yǎng)和發(fā)酵工藝在生長(zhǎng)有生產(chǎn)菌種菌落的LB(Amp)平板上，挑取單菌落接種進(jìn)5mlLB培養(yǎng)液中30℃培養(yǎng)12小時(shí)。取2ml轉(zhuǎn)接入200mlLB培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)3小時(shí)至OD6000.4左右，以1％比例轉(zhuǎn)接入10L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為TH培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)3小時(shí)至OD6000.4左右，在15min內(nèi)使培養(yǎng)溫度升高至42℃繼續(xù)培養(yǎng)2-5小時(shí)。發(fā)酵過程中PH控制在6.8-7.0之間，溶氧控制在30％以上；(2)菌體回收發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管，4℃,4000g離心15分鐘，棄上清液，用冰冷的TSE溶液(0.1M Tris,0.2M NaCl,0.05MEDTA,pH7.2)洗滌菌體兩次，得菌體50g左右。回收的菌體若不進(jìn)行裂解，則凍于-20℃保存；(3)菌體裂解采用超聲破碎法，每10克濕菌加TSE100ml，用300W功率進(jìn)行超聲，超聲30秒，停30秒，共超聲20分鐘。。然后將超聲破碎液離心(4℃,12,000g,10分鐘)，取菌體裂解上清(約50ml)倒入干凈的三角燒瓶?jī)?nèi)，用于進(jìn)一步純化；(4)鹽析與透析用硫酸銨對(duì)菌體裂解液上清進(jìn)行分級(jí)鹽析。將裝有500ml菌體裂解液上清的三角燒瓶置于冷柜中的磁力攪拌器上，緩慢加入固體硫酸銨，邊加邊攪，至硫酸銨達(dá)40％飽和度，然后靜置1小時(shí)。將上述鹽析物離心(4℃,12,000g,15分鐘)，上清倒入一干凈的三角燒瓶?jī)?nèi)，邊加邊攪，至硫酸銨達(dá)60％飽和度。4℃，靜置1小時(shí)。將鹽析物離心(4℃,12,000g,15分鐘)。棄掉上清，得沉淀約15g左右。沉淀用溶液Ⅰ(19mM Tris.Cl,PH7.2)溶解(每克沉淀加入10ml溶液Ⅰ)，然后裝入4個(gè)2×15cm的透析袋中，對(duì)10倍體積溶液Ⅰ透析72小時(shí)，每隔12小時(shí)換透析液一次；(5)離子交換層析將已經(jīng)處理好的Pharmacia DEAE-Sepharose CL-6B裝柱(5×15cm)，置冷柜中，用溶液Ⅰ平衡12小時(shí)，流速為3.5ml/min。將透析好的樣品上樣于平衡好的DEAE-Aepharose CL-6B柱上，進(jìn)行層析，流速為3.5ml/min。先用流動(dòng)相Ⅰ洗脫至洗脫曲線回基線，然后換用流動(dòng)相Ⅱ(20mM Tris-Cl,150mM NaCl,PH7.0-9.0)洗脫，可見兩個(gè)洗脫峰，收集洗脫液峰Ⅱ。樣品收集完畢后，用流動(dòng)相Ⅲ(20mMTris-Cl,1000mM NaCl,PH7.0-9.0)清洗層析柱；(6)分子篩層析將處理好的Sephacryl S-200填料裝柱(6.2×140cm)，置冰柜中，用溶液Ⅰ平衡12小時(shí)，流速5ml/min。將經(jīng)DEAE-SepharoseCL-6B柱層析洗脫樣品進(jìn)行超濾濃縮(超濾膜的截留分子量為10KD)至100ml左右。上樣平衡好的Sephacryl S-200柱，進(jìn)行層析。洗脫液為溶液Ⅰ，流速5ml/min。收集洗脫峰Ⅱ；(7)制劑與凍干將Sephacryl S-200柱層析樣品峰留樣待檢，其余立即加入人白蛋白保護(hù)劑至最終含量1％。測(cè)定樣品生物活性，根據(jù)活性測(cè)定結(jié)果，用磷酸緩沖液(20mMPB,PH7.0,0.48M NaCl)稀釋到50萬(wàn)單位/0.5ml的濃度，補(bǔ)加入白蛋白，至最終含量1％。然后用0.22um孔徑濾膜除菌，抽樣進(jìn)行生物活性測(cè)定、熱原質(zhì)試驗(yàn)和無(wú)菌試驗(yàn)。此三項(xiàng)檢測(cè)合格者進(jìn)行分裝，每支安瓿分裝0.5ml，內(nèi)含不少于rhTNF-NC50萬(wàn)單位。冷凍干燥后，熔封。
4.一種如權(quán)利要求3所述的一種新型重組人腫瘤壞死因子(rhTNF-NC)的制備方法，其特征在于其中所述的rhTNF-NC的工程菌的構(gòu)建具體制備步驟如下1)從于37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)的HMS174新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L燒瓶中，于37℃搖振培養(yǎng)約3小時(shí)；2)在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌的、用冰預(yù)冷的50ml離心管中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0℃；3)于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以回收細(xì)胞；4)倒出培養(yǎng)液，以10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸沉淀，放置于冰上30分鐘；5)于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，以收回細(xì)胞；6)倒出培養(yǎng)液，用2ml冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2重懸細(xì)胞沉淀，即為HMS174感受態(tài)細(xì)胞；7)取200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，加入pJLA-hTNFNC質(zhì)粒DNA(體積＜10μl,DNA＜50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，在冰中放置30分鐘；8)將它放入42℃水溶90秒，不要搖動(dòng)?？焖賹⒐芊湃氡≈?，使細(xì)胞冷卻1-2分鐘；9)每管加入800μl 37℃的LB培養(yǎng)液，在37℃搖床上，溫浴45分鐘；10)將適當(dāng)體積的已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂到LB瓊脂平板上；11)將平板倒置，于37℃培養(yǎng)，12-16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型重組人腫瘤壞死因子(rhTNF－NC),它與天然TNF相比,在氨基端1—7位氨基酸殘基缺失,第8、9、10位氨基酸被置換,羧基末端Ala和Leu至少一個(gè)被置換,抗腫瘤療效高、毒副作用小。本發(fā)明提供了制備方法,可供工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/525GK1220997SQ9712520
公開日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年12月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月26日
發(fā)明者何曉龍, 何成, 路長(zhǎng)林 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)