專利名稱：環(huán)戊烯酮的衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于在醫(yī)藥領(lǐng)域中有用的、具有抗癌作用等生理活性的環(huán)戊烯酮衍生物以及該化合物的制造方法。
以往，臨床治療方法中使用的藥物主要是烷基化劑、代謝抑制劑、植物生物堿等抗癌藥、抗生素、免疫促進(jìn)劑和免疫調(diào)節(jié)劑等多種藥劑，但這些藥物療法還不能說已經(jīng)十分完善。
研究報(bào)告指出，在這些藥物中，由天然物質(zhì)得來的前列腺素中在5員環(huán)上具有α，β-不飽和羰基的前列腺素A和J類能抑制DNA合成，可以作為安全性高的抗癌藥，目前已經(jīng)合成了它們的各種衍生物(參見特開昭62-96438)。
本發(fā)明的目的是，研制具有抗癌作用等生理作用的環(huán)戊烯酮衍生物，提供該化合物的制造方法以及含有該化合物的藥物。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使由[III]式表示的4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮(以下簡稱環(huán)戊烯酮)與醇和/或其反應(yīng)性衍生物反應(yīng)，可以生成由[II]式表示的環(huán)戊烯酮衍生物，該環(huán)戊烯酮衍生物具有很強(qiáng)的癌細(xì)胞增殖抑制活性等生理活性。
本發(fā)明可以概括如下本發(fā)明的第1發(fā)明是關(guān)于由下列通式[I]表示的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽。
式中，R1和R2是相同或不同的直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、芳基、芳脂族基或H，但不包括R1＝R2＝H、或R1＝芐基時(shí)R2＝H的情況。
本發(fā)明的第2發(fā)明是關(guān)于由通式[II]表示的環(huán)戊烯酮衍生物的制造方法，其特征是，使由下列[III]式表示的4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和/或其旋光物與相當(dāng)于由下列通式[II]表示的環(huán)戊烯酮衍生物的R3、R4的醇和/或其反應(yīng)性衍生物同時(shí)或依次反應(yīng)。
式中，R3和R4是相同或不同的直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、芳基、芳脂族基或H。但不包括R3＝R4＝H的情況。
本發(fā)明的第3發(fā)明是關(guān)于一種藥物，其特征是，該藥物含有選自本發(fā)明的第1發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽中的化合物作為有效成分。
本發(fā)明的第4發(fā)明是關(guān)于一種藥物，其特征是，該藥物含有選自用本發(fā)明的第2發(fā)明的方法得到的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物作為有效成分。
在本發(fā)明的第3和第4發(fā)明中，優(yōu)選的方案是，上述藥物為抗癌藥、細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑。
附圖的簡要說明

圖1是表示4-芐基環(huán)戊烯酮醚的1H-NMR譜的圖。
圖2是表示5-芐基環(huán)戊烯酮醚的1H-NMR譜的圖。
圖3是表示4，5-二芐基環(huán)戊烯酮醚的1H-NMR譜的圖。
圖4是表示4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚的1H-NMR譜的圖。
圖5是表示5-叔丁基環(huán)戊烯酮醚的1H-NMR譜的圖。
圖6是表示4，5-二-叔丁基環(huán)戊烯酮醚的1H-NMR譜的圖。
圖7是表示(-)-環(huán)戊烯酮的對二甲氨基苯甲?；苌锏腃D和(-)-環(huán)戊烯酮的立體結(jié)構(gòu)的圖。
圖8是表示(+)-環(huán)戊烯酮的對二甲氨基苯甲?；苌锏腃D和(+)-環(huán)戊烯酮的立體結(jié)構(gòu)的圖。
圖9是表示4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚或4，5-二-叔丁基環(huán)戊烯酮醚的量與足浮腫增加率的關(guān)系圖。
發(fā)明的實(shí)施方式下面具體地說明本發(fā)明。
本發(fā)明中使用的由[III]式表示的環(huán)戊烯酮，其4位和5位的羥基的立體構(gòu)型包括順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體兩種情況。在本發(fā)明中，可以使用順式環(huán)戊烯酮，反式環(huán)戊烯酮，或者順式環(huán)戊烯酮與反式環(huán)戊烯酮的混合物。另外，也可以使用它們的旋光物。
順式環(huán)戊烯酮可以用化學(xué)合成法制備[參見(Helvetica Chimica Acta)、第55卷、第2838-2844頁(1972)]。反式環(huán)戊烯酮也可以用化學(xué)合成法制備[參見(Carbohybrate Res.)、第247卷、第217-222頁(1993)]，另外，還可以通過對糖醛酸(例如葡糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡糖醛酸內(nèi)酯)等進(jìn)行加熱處理而制備(參見PCT/JP97/03052說明書)。在本發(fā)明中，也可以使用含有環(huán)戊烯酮的上述加熱處理物、其部分精制物以及精制物。
例如，糖醛酸使用D-葡糖醛酸，將其1％溶液在121℃下加熱處理4小時(shí)，使加熱處理物中生成環(huán)戊烯酮。用溶劑萃取該加熱處理物中的環(huán)戊烯酮，濃縮萃取物。然后用硅膠柱色譜分離該濃縮物，濃縮溶出的環(huán)戊烯酮級分，用氯仿從濃縮物中提取環(huán)戊烯酮，對提取的濃縮物進(jìn)行正相柱色譜分離，離析加熱處理物中的環(huán)戊烯酮。
環(huán)戊烯酮的物性列出如下。環(huán)戊烯酮的質(zhì)譜分析是采用DX302質(zhì)譜儀(日本電子社制造)進(jìn)行的。另外，使用重氯仿溶劑的NMR譜的測定是采用JNM-A500(日本電子社制造)。旋光率、UV吸收譜和紅外吸收光譜(IR)分別是使用DIP-370型旋光計(jì)(日本分光社制造)、UV-2500分光光度計(jì)(島津制作所制造)和FTIR-8000紅外分光光度計(jì)(島津制作所制造)。
MS m/z 115〔M+H〕+1H-NMR(CDCl3)δ4.20(1H，d，J＝2.4Hz，5-H)、4.83(1H，m，4-H)、6.30(1H，dd，J＝1.2，6.1Hz，2-H)、7.48(1H，dd，J＝2.1，6.1Hz，3-H)其中，1H-NMR的化學(xué)位移值是以CHCl3的化學(xué)位移值為7.26ppm表示的。
旋光度[α]D200°(c 1.3、水)UVλmax 215nm(水)IR(KBr法)在3400、1715、1630、1115、1060、1025cm-1有吸收。
對離析的環(huán)戊烯酮進(jìn)行光學(xué)離析，可以得到(-)-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。
例如，將環(huán)戊烯酮溶解在乙醇中，向該乙醇溶液中添加己烷/乙醇(94/6)，制備環(huán)戊烯酮溶液。例如使用Chiral Pack As(ダィセル化學(xué)工業(yè))柱，在柱溫40℃、流動(dòng)相己烷/乙醇(94/6)條件下對該試樣溶液進(jìn)行HPLC，可以將環(huán)戊烯酮光學(xué)離析。
離析的(-)-反式-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮[以下簡稱(-)-環(huán)戊烯酮]的旋光度是[α]D20-105°(c 0.30、乙醇)，(+)-反式-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮[以下簡稱(+)-環(huán)戊烯酮]的旋光度是[α]D20+104°(c 0.53、乙醇)。另外，旋光度是用上述DIP-370型旋光計(jì)(日本分光社制造)測定的。
隨后，按上面所述的方法，采用質(zhì)譜分析、核磁共振(NMR)對(-)-環(huán)戊烯酮和(+)-環(huán)戊烯酮分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，測定UV吸收光譜和紅外吸收光譜。結(jié)果，這兩種旋光物顯示出與光學(xué)離析前的環(huán)戊烯酮相同的結(jié)果。
設(shè)經(jīng)過光學(xué)離析的(-)-環(huán)戊烯酮和(+)-環(huán)戊烯酮分別作為對二甲氨基苯甲?；苌?，使用J-720型圓二色性分散計(jì)(日本分光社制造)，測定圓二色性光譜(CD)，將所得結(jié)果用于二苯甲酸酯手性規(guī)則[參見J.Am.Chem.Soc.、第91卷、第3989-3991頁(1969)]，確定其立體構(gòu)型。
圖7中示出(-)-環(huán)戊烯酮的對二甲氨基苯甲?；苌锏腃D和(-)-環(huán)戊烯酮的立體結(jié)構(gòu)。圖中，縱軸表示摩爾圓二色性，橫軸表示波長(nm)。另外，上述立體結(jié)構(gòu)用[IV]式表示如下
圖8中示出(+)-環(huán)戊烯酮的對二甲氨基苯甲?；苌锏腃D和(+)-環(huán)戊烯酮的立體結(jié)構(gòu)。圖中，縱軸表示摩爾圓二色性，橫軸表示波長(nm)。另外，上述立體結(jié)構(gòu)用[V]式表示如下
如同圖7、8和[IV]式、[V]式所示，(-)-環(huán)戊烯酮是(-)-(4R，5S)-反式-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮，(+)-環(huán)戊烯酮是(+)-(4S，5R)-反式-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮。
以上使用的環(huán)戊烯酮或其旋光物可以用任一方法制造，可以用說明書中所述的方法制造，也可以用其它化學(xué)合成方法合成，在本發(fā)明中也可以使用環(huán)戊烯酮的反式體、順式體、它們的混合物以及它們的旋光物。
將環(huán)戊烯酮和/或其旋光物與具有直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、芳基或芳脂族基的醇和/或其反應(yīng)性衍生物同時(shí)或依次反應(yīng)，在反應(yīng)液中生成本發(fā)明的由通式[II]表示的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物。
具有烷基的醇可以使用具有直鏈或支鏈烷基的醇，烷基鏈的鏈長可以根據(jù)環(huán)戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等適當(dāng)選擇。
具有直鏈烷基的醇例如可以使用甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十二烷醇、十四烷醇、十六烷醇、十八烷醇等。
具有支鏈烷基的醇例如可以使用異丁酸、叔丁醇、異戊醇、叔戊醇等。
具有鏈烯基的醇可以使用具有直鏈或支鏈鏈烯基的醇，鏈烯基的鏈長、不飽和度以及不飽和鍵的位置可以根據(jù)環(huán)戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等適當(dāng)選擇。
具有直鏈鏈烯基的醇例如可以使用丙烯醇、烯丙醇、丁烯醇、3-己烯-1-醇等。
具有支鏈鏈烯基的醇例如可以使用香葉醇、法呢醇、龍牛兒基香葉醇、松香油、沉香醇、橙花叔醇、橙花醇等。
具有芳基的醇例如可以使用苯酚、甲酚、硝基苯酚、氯苯酚、溴苯酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚、萘酚等，可以根據(jù)生成的環(huán)戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等選擇所使用的具有芳基的醇。
具有芳脂族基的醇例如可以使用苯甲醇、苯乙醇、苯酰甲醇、苯代乙二醇、苯基丙醇等，可以根據(jù)生成的環(huán)戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等選擇所使用的具有芳烷基的醇。
本發(fā)明中使用的醇的反應(yīng)性衍生物例如可以舉出鹵代烷、芳基鹵、酸酯、重氮基化合物、鹽、醇的脫水物鏈烯等，可以根據(jù)要達(dá)到的目的制備所使用的醇的反應(yīng)性衍生物。
醇以及/或其反應(yīng)性衍生物與環(huán)戊烯酮的反應(yīng)，可以按照式II所示的環(huán)戊烯酮衍生物中的R3和R4相同的方式進(jìn)行，也可以按照R3與R4中任一個(gè)為未反應(yīng)的H的方式進(jìn)行，也可以按照R3與R4不同的方式進(jìn)行。即，可以使環(huán)戊烯酮的2個(gè)羥基同時(shí)反應(yīng)，也可以僅使任意一個(gè)反應(yīng)，也可以使R3與R4不同的醇及/或其反應(yīng)性衍生物同時(shí)與環(huán)戊烯酮反應(yīng)，也可以使R3與R4不同的醇及/或其反應(yīng)性衍生物依次與環(huán)戊烯酮進(jìn)行反應(yīng)。此時(shí)，通過保護(hù)環(huán)戊烯酮中的一個(gè)羥基，可以高效率地制備R3與R4不同或R3與R4中任一個(gè)被醚化的環(huán)戊烯酮衍生物。
另外，本發(fā)明提供的式I表示的環(huán)戊烯酮中，該環(huán)戊烯酮衍生物的R1與R2可以相同，也可以是R1與R2中任一個(gè)為未反應(yīng)的H，R1與R2也可以不同。
環(huán)戊烯酮或其旋光物與醇及/或其反應(yīng)性衍生物反應(yīng)，生成的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物具有很強(qiáng)的癌細(xì)胞增殖抑制活性，可以以該活性作為指標(biāo)從反應(yīng)液中提純、分離環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物。提純、分離的方法可以采用化學(xué)方法或物理方法等公知的純化方法，可以將凝膠過濾法、利用分子量分級薄膜的分級法、溶劑萃取法、分餾法、使用離子交換樹脂、正相、反相等各種色譜法等以往公知的純化方法組合使用，提純和離析反應(yīng)生成物中的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物。
例如，在氬氣氣流下，將環(huán)戊烯酮或其旋光物與苯甲醇或叔丁基醇的三氯乙酰亞胺酸酯溶解在三氯甲烷中，添加三氟化硼二乙醚絡(luò)合物的二氯甲烷溶液使之反應(yīng)，生成本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物。
將環(huán)戊烯酮或其旋光物溶解在四氫呋喃中，添加鹵代烷與氫化鈉使之反應(yīng)，生成本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物。
將環(huán)戊烯酮或其旋光物溶解在二噁烷中，添加氫氧化鈣和硫酸二甲酯使之反應(yīng)，生成本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物。
將環(huán)戊烯酮或其旋光物溶解在二氯甲烷中，添加二異丙基乙胺與三乙基氧翁四氟硼酸鹽使之反應(yīng)，生成本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物。
將環(huán)戊烯酮或其旋光物溶解在二氯甲烷中，添加三氟甲烷磺酸與鏈烯使之反應(yīng)，生成本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物。
以上生成的本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物根據(jù)需要可以采取溶劑萃取、柱色譜法、薄層色譜法等其它公知的方法提純、分離。
由本發(fā)明得到的環(huán)戊烯酮衍生物的旋光物，可以通過消旋混合物的機(jī)械分離進(jìn)行離析，優(yōu)先選用結(jié)晶法離析，作為非對映立體異構(gòu)物鹽或包合物結(jié)晶而離析，采用酶·微生物的動(dòng)力學(xué)離析，以及采用色譜進(jìn)行離析。
采用色譜進(jìn)行離析，可以使用氣相色譜、液相色譜或薄層色譜等，可以使用與它們相適應(yīng)的手性固定相。
采用液相色譜進(jìn)行光學(xué)離析，可以采用使用手性固定相的方法、使用手性洗提液的方法以及作為非對映立體異構(gòu)物的分離等方法。
手性固定相可以使用酰胺系固定相、尿素系固定相、配位基交換型固定相、多糖·多糖衍生物固定相、蛋白質(zhì)固定相、聚甲基丙烯酸酯固定相、聚甲基丙烯酰胺固定相等。
洗提液可以使用己烷系、醇系、水(緩沖液)系等，與上述固定相組合適當(dāng)使用。
本發(fā)明所得到的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物的鹽，有些是可以用作藥物的鹽，可以采用公知的方法轉(zhuǎn)換。
本發(fā)明所得到的式I或式II表示的環(huán)戊烯酮衍生物(以下簡稱本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物)或其旋光物或者它們的鹽，具有抗癌活性、癌細(xì)胞增殖抑制活性、細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性、拓?fù)洚悩?gòu)酶(トポィソ メラ一ゼ)II阻礙活性、癌細(xì)胞分化誘導(dǎo)活性、抗風(fēng)濕活性、慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕抑制作用、ファス抗原產(chǎn)生誘導(dǎo)活性、抗菌活性、抗病毒活性、肝功能改善活性、熱激蛋白誘導(dǎo)活性、血液成分正?；钚?、癌免疫增強(qiáng)活性、抗炎活性、腫瘤壞死因子產(chǎn)生抑制活性、一氧化氮產(chǎn)生抑制活性、免疫調(diào)節(jié)活性，例如延遲型過敏反應(yīng)抑制活性、淋巴細(xì)胞幼年化反應(yīng)抑制活性、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)抑制活性、IgE產(chǎn)生抑制活性、角叉菜膠浮腫抑制活性等的生理活性，利用這些活性，含有選自本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物作為有效成分的藥品，作為作用于機(jī)體防御機(jī)構(gòu)的藥品、例如作用于抗體產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的制劑如抗炎劑、抗過敏劑、抗風(fēng)濕劑、干擾素誘導(dǎo)劑等，作用于糖代謝的醫(yī)藥如糖尿病治療劑，作用于病原微生物的醫(yī)藥如抗菌劑、抗病毒劑等有用。所以本發(fā)明得到的醫(yī)藥，作為對本發(fā)明化合物或其旋光物或者它們的鹽具有感受性的疾病的醫(yī)藥，對治療或預(yù)防例如癌癥、病毒性疾病、風(fēng)濕、糖尿病、過敏、自身免疫性疾病、炎癥等疾病的藥物極為有效。
本發(fā)明的化合物或其旋光物或者它們的鹽，對以下癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，例如人前骨髓性白血病細(xì)胞HL-60、人急性淋巴芽球性白血病細(xì)胞MOLT-3、肺癌細(xì)胞A-549、SV40形質(zhì)轉(zhuǎn)換肺細(xì)胞WI-38VA13、肝癌細(xì)胞Hep G2、結(jié)腸癌細(xì)胞HCT 116、人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、人結(jié)腸癌細(xì)胞WiDr、胃癌細(xì)胞AGS、骨髓瘤細(xì)胞等，以選自本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物作為有效成分，將其與公知的藥用載體組合形成制劑，制成抗癌藥。本發(fā)明所得到的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的癌細(xì)胞增殖抑制作用對本發(fā)明沒有任何限制作用，例如，本發(fā)明的制癌作用還包含對于癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘發(fā)作用、拓?fù)洚悩?gòu)酶的阻礙作用。
抗癌藥一般可以按下述方法制造，將選自環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物與藥學(xué)上允許的液體或固體的載體配合，必要時(shí)添加溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、粘結(jié)劑、崩解劑、潤滑劑等，制成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固形制劑或通常液劑、懸浮劑、乳劑等溶液劑。另外，還可以制成干燥制品，在使用之前添加適當(dāng)?shù)妮d體，形成液狀。
藥用載體可以根據(jù)上述給藥方式和劑型加以選擇，對于經(jīng)口給藥的制劑來說，例如可以使用淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機(jī)鹽等。另外，在制備經(jīng)口給藥的制劑時(shí)，還可以配入粘結(jié)劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、流動(dòng)性促進(jìn)劑、矯味劑、著色劑、香料等。
另一方面，對于非經(jīng)口給藥的制劑來說，將本發(fā)明的有效成分即選自環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物溶解或懸浮于作為稀釋劑的注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，必要時(shí)添加殺菌劑、穩(wěn)定劑、等張化劑、鎮(zhèn)痛劑等，制成制劑。
本發(fā)明的抗癌藥可以采用與制劑形態(tài)相應(yīng)的適當(dāng)給藥途徑給藥。給藥方法沒有特別的限制，可以內(nèi)用、外用或注射。注射劑例如可以通過靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射給藥，外用劑也包括栓劑等。
抗癌藥的給藥量可以根據(jù)制劑形式、給藥方法、使用目的以及患者的年齡、體重、癥狀等適當(dāng)設(shè)定，不是一成不變的，一般地說，制劑中所含的、選自環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物的量為成人每日0.1μg～200mg/kg。當(dāng)然，給藥量根據(jù)各種條件而有所變化，有的時(shí)候比上述給藥量少，也有的時(shí)候比上述給藥量多。本發(fā)明的藥劑除了直接經(jīng)口給藥外，還可以添加到日常的任何食品飲料中攝入。
本發(fā)明所得到的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽具有細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性，可以從這些化合物中選擇至少一種化合物作為有效成分，制成細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑。細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑可以按照上述抗癌藥中所述的方法制成制劑，并按抗癌藥中所述的方法給藥。
細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑的給藥量可以根據(jù)制劑形式、給藥方法、使用目的以及患者的年齡、體重、癥狀等適當(dāng)設(shè)定，不是一成不變的，一般地說，制劑中所含的、選自環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或它們的鹽的量為成人每日0.1μg～100mg/kg。當(dāng)然，給藥量根據(jù)各種條件而有所變化，有的時(shí)候比上述給藥量少，也有的時(shí)候超過上述給藥量范圍。本發(fā)明的藥劑除了直接經(jīng)口給藥外，還可以添加到日常的任何食品飲料中攝入。
一般認(rèn)為，細(xì)胞凋亡作用與病理學(xué)上所說的細(xì)胞死亡即壞死不同，是從一開始就編入細(xì)胞本身的基因中的死亡。即，任何外部或內(nèi)部的因素都可能誘發(fā)編程細(xì)胞凋亡作用的基因活化，基于該基因而生物合成編程性細(xì)胞死亡基因蛋白質(zhì)，或有時(shí)可以使細(xì)胞內(nèi)存在的不活性型編程死亡蛋白質(zhì)活性化。由于生成的編程性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)的作用使細(xì)胞本身分解，導(dǎo)致死亡。本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑可以在所希望的組織和細(xì)胞中誘發(fā)這種細(xì)胞凋亡作用，以自然的形式從生物體中排除不需要的細(xì)胞或病源細(xì)胞，因而是極其有用的。
即，本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑在排除自身免疫疾病患者的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞、癌細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞等依然有效，通過在所希望的組織和細(xì)胞中誘發(fā)這種細(xì)胞凋亡作用，以自然的形式從生物體中排除不需要的細(xì)胞或病源細(xì)胞。作為本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑有效的疾病，例如全身性紅斑狼瘡、免疫介在性系球體腎炎、多發(fā)性硬化癥、膠原病等自身免疫性疾患、風(fēng)濕等。
本發(fā)明的細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑可以在細(xì)胞凋亡作用誘發(fā)方法中使用。即，使用本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽作為有效成分，可以誘發(fā)細(xì)胞凋亡作用，該方法對于弄清細(xì)胞凋亡誘發(fā)機(jī)理以及篩選細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑和細(xì)胞凋亡誘發(fā)抑制劑等十分有用。
角叉菜膠足浮腫的模型，是通過在足部皮下注射發(fā)炎劑角叉菜膠，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，由這些細(xì)胞的產(chǎn)生的炎癥性因子使血管通透性亢進(jìn)，引起浮腫。本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽具有角叉菜膠浮腫的抑制作用，含有選自這些化合物的化合物作為有效成分的醫(yī)藥，作為治療或預(yù)防有必要抑制血管通透性亢進(jìn)的炎癥性疾病，例如慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕等的抗炎劑、抗風(fēng)濕劑有用。
本發(fā)明提供了含有從本發(fā)明得到的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽中選擇至少一種化合物作為有效成分的拓?fù)洚悩?gòu)酶阻礙劑，以及使用從這些化合物中選擇至少一種化合物作為有效成分的拓?fù)洚悩?gòu)酶的阻礙方法。該拓?fù)洚悩?gòu)酶阻礙劑作為抗癌劑有用，該拓?fù)洚悩?gòu)酶阻礙方法對進(jìn)行生化學(xué)研究和篩選抗癌劑有用。
另外，通過本發(fā)明，提供了含有從本發(fā)明的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物中選擇的至少一種化合物作為有效成分的藥品，可以作用于機(jī)體防御機(jī)構(gòu)，例如作用于抗體產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的制劑如抗炎劑、抗過敏劑、抗風(fēng)濕劑、干擾素誘導(dǎo)劑等，作用于糖代謝的醫(yī)藥如糖尿病治療劑，作用于病原微生物的醫(yī)藥如抗菌劑、抗病毒劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶阻礙劑等，可以按照抗癌劑的方法進(jìn)行制劑化，按照抗癌劑的方法用量給藥。
通過本發(fā)明得到的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或它們的鹽，可以通過將環(huán)戊烯酮與任意的醇或其反應(yīng)衍生物高效制造，通過本發(fā)明可以提供式II表示的環(huán)戊烯酮衍生物或旋光物或它們的鹽。
含有本發(fā)明得到的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽作為有效成分的食品或飲料的制造方法沒有特別的限制，可以采用烹飪、加工以及常用的食品或飲料的制造方法制造，只要制得的食品或飲料中含有有效量的選自具有生理作用的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽的化合物即可。
本發(fā)明得到的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽，將其以生理活性的有效量給藥時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)毒性。例如，在經(jīng)口給藥的場合，以300mg/kg的劑量將4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚或其旋光物或者它們的鹽、4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚或其旋光物或者它們的鹽給小鼠一次性經(jīng)口給藥時(shí)，沒有發(fā)現(xiàn)死亡例。
本發(fā)明所得到的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽可以簡便地制造，由于具有各種生理作用，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。
實(shí)施例下面通過實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。另外，實(shí)施例中的％表示重量％。
實(shí)施例1(1)將10g D-葡糖醛酸(Sigma公司制造G5269)溶解在1升的水中，在121℃下加熱4小時(shí)，然后減壓濃縮至10ml左右。向其中添加醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2混合液的上層40ml，混合后離心分離，在減壓下將所得上清液濃縮至約10ml。
將上述提取液加到柱色譜用硅膠BW-300SP(2×28cm，富士Silycia化學(xué)社制造)上，以醋酸丁酯∶醋酸∶水＝3∶2∶2的上層作為洗提液，用空氣壓縮機(jī)加壓至0.2kg/cm2，以每分鐘5ml的流速進(jìn)行分離。按照每1級分10ml進(jìn)行分級分離，每1級分取一部分，用薄層色譜分析，從第61至80級分中含有高純度的環(huán)戊烯酮。將這些級分匯集到一起，減壓下濃縮，然后用40ml的氯仿萃取，在減壓下濃縮萃取液，得到100mg的環(huán)戊烯酮。
采用使用Palpack型S柱的正相HPLC分離該級分，用215nm的紫外線吸收進(jìn)行檢測，結(jié)果純度為98％。
將113.9mg上述環(huán)戊烯酮溶解在2.85ml乙醇中，再向該乙醇溶液中添加己烷/乙醇(94/6)3.85ml，制成17mg/ml的環(huán)戊烯酮溶液。用0.5μm的過濾器過濾該溶液，將其作為光學(xué)離析HPLC試樣溶液。
按以下條件對該試樣溶液進(jìn)行光學(xué)離析HPLC，分別收集前峰的(-)-環(huán)戊烯酮和后峰的(+)-環(huán)戊烯酮的級分，減壓干固，分別得到(-)-環(huán)戊烯酮43.2mg和(+)-環(huán)戊烯酮43.0mg。
光學(xué)離析HPLC條件柱Chiral Pack AS(Daicel化學(xué)工業(yè))2.0cm×25.0cm柱溫度40℃移動(dòng)相己烷/乙醇(94/6)流速14.0ml/分檢測UV210nm試樣注入量150μl(2.55mg)按上述條件再次進(jìn)行光學(xué)離析，以使所得到的(-)-環(huán)戊烯酮和(+)-環(huán)戊烯酮兩者總共含有約1％的對映體。結(jié)果，從前峰的(-)-環(huán)戊烯酮30.0mg中得到19.7mg不含對映體的(-)-環(huán)戊烯酮，從后峰的(+)-環(huán)戊烯酮37.4mg中得到27.7mg的不含對映體的(+)-環(huán)戊烯酮。另外，(-)-環(huán)戊烯酮和(+)-環(huán)戊烯酮的光學(xué)離析HPLC的溶出時(shí)間分別為33分鐘和40分鐘。
(2)在氬氣氣流下，將44mg的環(huán)戊烯酮和492mg的芐基2，2，2-三氯乙酰亞胺酯(Aldrich公司制，14，033-3)溶解在2.5ml三氯甲烷(和光純藥公司制，135-02441)中。邊攪拌邊向其中緩慢添加28μl/ml的三氟硼酸化硼乙醚絡(luò)合物(和光純藥公司制，022-08362)的二氯甲烷1ml。在室溫下攪拌8小時(shí)后，減壓濃縮，使用氯仿∶甲醇＝19∶1作為展開溶劑利用硅膠薄層色譜精制4-芐基環(huán)戊烯酮醚、5-芐基環(huán)戊烯酮醚以及4，5-二芐基環(huán)戊烯酮醚。4-芐基環(huán)戊烯酮醚的Rf值為0.3、5-芐基環(huán)戊烯酮醚的Rf值為0.45、4，5-二芐基環(huán)戊烯酮醚的Rf值為0.8。收率4-芐基環(huán)戊烯酮醚為3.7％、5-芐基環(huán)戊烯酮醚為3.7％、4，5-二芐基環(huán)戊烯酮醚為2.5％。
(3)通過核磁共振法(NMR)確認(rèn)由實(shí)施例1-(2)所得到的4-芐基環(huán)戊烯酮醚、5-芐基環(huán)戊烯酮醚、以及4，5-二芐基環(huán)戊烯酮醚的構(gòu)造。核磁共振裝置使用JNM-EX270 FT NMR系統(tǒng)(日本電子公司制)。另外，1H-NMR的化學(xué)位移值是以四甲基硅烷的化學(xué)位移值為0ppm表示。結(jié)果如下所示。
4-芐基環(huán)戊烯酮醚1H-NMRδ7.47(1H，dd，J＝6.0Hz，J＝1.68)，δ7.36(5H，m)，δ6.3(1H，dd，J＝6.0Hz，J＝1.33Hz)，δ4.88(1H，d，J＝11.55)，δ4.75(1H，d，J＝11.55)，δ4.55(1H，m)，δ4.28(1H，m)，δ2.78(1H，m)5-芐基環(huán)戊烯酮醚1H-NMRδ7.39(6H，m)，δ6.22(1H，dd，J＝6.24Hz，J＝1.32Hz)，δ5.09(1H，d，J＝11.87)，δ4.79(1H，m)，δ4.77(1H，d，J＝11.87)，δ3.98(1H，d，J＝2.97)，δ2.06(1H，m)4，5-二芐基環(huán)戊烯酮醚1H-NMRδ7.47(1H，dd，J＝6.27Hz，J＝1.98)，δ7.34(10H，m)，δ6.29(1H，dd，J＝6.10Hz，J＝1.49Hz)，δ4.88(1H，d，J＝11.85)，δ4.74(1H，d，J＝11.85)，δ4.71(2H，d，J＝11.55)，δ4.56(1H，m)，δ4.33(1H，d，J＝2.64)這些衍生物的1H-NMR譜如圖1～3所示。即，圖1為4-芐基環(huán)戊烯酮醚的NMR譜、圖2為5-芐基環(huán)戊烯酮醚的NMR譜、圖3為4，5-二芐基環(huán)戊烯酮醚的NMR譜。圖1～圖3的橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)、縱軸表示信號的強(qiáng)度。
(4)在氬氣氣流下，將44mg的環(huán)戊烯酮和287mg的叔丁基2，2，，2-三氯乙酰亞胺酯(Aldrich公司制，36，478-9)溶解在2.5ml三氯甲烷中。一邊攪拌邊向其中緩慢添加28μl/ml的三氟硼酸化硼乙醚絡(luò)合物的二氯甲烷溶液1ml。在室溫下攪拌8小時(shí)后，減壓濃縮，按實(shí)施例1-(2)同樣使用硅膠薄層色譜精制4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚、5-叔丁基環(huán)戊烯酮醚以及4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚。4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚的Rf值為0.35、5-叔丁基環(huán)戊烯酮醚的Rf值為0.27、4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚的Rf值為0.73。收率4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚為9.2％、5-叔丁基環(huán)戊烯酮醚為1.9％、4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚為11％。
(5)按實(shí)施例1-(3)相同的方法利用NMR確認(rèn)由實(shí)施例1-(4)得到的4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚、5-叔丁基環(huán)戊烯酮醚、以及4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚的構(gòu)造。結(jié)果如下所示。
4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚1H-NMRδ7.34(1H，dd，J＝5.94Hz，J＝0.99)，δ6.25(1H，dd，J＝6.10，J＝1.49)，δ4.59(1H，m)，δ4.08(1H，d，J＝2.31)，δ2.85(1H，m)，δ1.33(9H，s)5-叔丁基環(huán)戊烯酮醚1H-NMRδ7.37(1H，dd，J＝6.27Hz，J＝1.98)，δ6.23(1H，dd，J＝6.27，J＝1.32)，δ4.75(1H，m)，δ4.04(1H，d，J＝2.63)，δ2.23(1H，m)，δ1.32(9H，s)4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚1H-NMRδ7.35(1H，dd，J＝6.27Hz，J＝1.65)，δ6.24(1H，dd，J＝6.26，J＝0.99)，δ4.62(1H，ddd，J＝3.3，J＝1.65，J＝0.99)，δ4.16(1H，d，J＝3.31)，δ1.38(18H，s)這些衍生物的1H-NMR譜如圖4～6所示。即，圖4為4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚的NMR譜、圖5為5-叔丁基環(huán)戊烯酮醚的NMR譜、圖6為4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚的NMR譜。圖4～圖的橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)、縱軸表示信號的強(qiáng)度。
實(shí)施例2將4-芐基環(huán)戊烯酮醚、5-芐基環(huán)戊烯酮醚、或4，5-二芐基環(huán)戊烯酮醚的1.22、2.44、4.88、9.77、19.5、39.1、78.1、156、313、625、1250、2500、5000或10000μg/ml溶液(在70％的乙醇水溶液中)、或作為對照的70％乙醇水溶液10μl，分別添加至裝入96孔微量滴定板的加樣孔中，風(fēng)干后，將前骨髓性白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞(ATCC CCL-240)在含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中混懸形成1×105個(gè)/ml，分別取100μl添加至各加樣孔中，在5％二氧化碳存在下37℃培養(yǎng)48小時(shí)。用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，添加5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑噁溴化物(MTT；Sigma公司制)磷酸緩沖食鹽水溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后用顯微鏡觀察細(xì)胞的發(fā)育狀況。另外，添加含有0.04N HCl的2-丙醇100μl，充分?jǐn)嚢?，測定590nm的吸光度。
結(jié)果表明，在4-芐基環(huán)戊烯酮醚的添加級分(最終濃度0.244μg/ml、1.20μM)2.44μg/ml、5-芐基環(huán)戊烯酮醚的添加級分(最終濃度1.95μg/ml、9.56μM)19.5μg/ml、4，5-二芐基環(huán)戊烯酮醚的添加級分(最終濃度15.6μg/ml、53.1μM)156μg/ml下，細(xì)胞增殖受到完全抑制。沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡小體的形成。另外添加低濃度級分時(shí)與添加水作為對照時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)差別。
(2)按實(shí)施例2-(1)相同的方法測定4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚、5-叔丁基環(huán)戊烯酮醚、或4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚對HL-60細(xì)胞的增殖的影響。
結(jié)果表明，在4-芐基環(huán)戊烯酮醚的添加級分(最終濃度31.3μg/ml、180μM)313μg/ml、5-芐基環(huán)戊烯酮醚的添加級分(最終濃度7.81μg/ml、46μM)78.1μg/ml、4，5-二芐基環(huán)戊烯酮醚的添加級分(最終濃度62.5μg/ml、280μM)625μg/ml下，細(xì)胞增殖受到完全抑制。沒有發(fā)現(xiàn)凋亡小體的形成。另外添加低濃度級分時(shí)與添加水作為對照時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)差別。
上述化合物顯示癌細(xì)胞增殖抑制活性以及細(xì)胞凋亡誘發(fā)活性。另外，這些化合物的旋光物也顯示出同樣的癌細(xì)胞增殖抑制活性和細(xì)胞凋亡誘發(fā)作用。
實(shí)施例3從セァック吉富(株)購入路易斯大白鼠(雄性，9周，體重約250g)，如下所示制成炎癥模型，例如作為慢性關(guān)節(jié)炎風(fēng)濕模型的角叉菜膠誘發(fā)足浮腫模型，評價(jià)被測物質(zhì)。
將4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚或4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚溶解在橄欖油中調(diào)節(jié)至各濃度，以1mg/10ml/kg或10mg/10ml/kg的給藥量經(jīng)口給予在實(shí)驗(yàn)開始前18小時(shí)絕食的大白鼠。在給予這些被測物質(zhì)0.5小時(shí)后，將λ-角叉菜膠在生理食鹽水(大冢制藥)中混懸調(diào)整濃度為1％，以100μl/kg的給藥量在大鼠足部注射，引起足部浮腫。用大白鼠足容積測定裝置(ゥゴバジ一ル公司制)測定角叉菜膠注射3小時(shí)后大白鼠的右足容積。測定值表示經(jīng)計(jì)算與給予角叉菜膠前測定的各大白鼠的右足容積的增加值。
結(jié)果如圖9所示，即圖9表示各化合物與足增加率的關(guān)系圖，縱軸表示增加率(％)，橫軸表示各化合物的給藥量(mg/kg)。圖中A表示4-叔丁基環(huán)戊烯酮醚給藥組，B表示4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚給藥組。各化合物均顯示有角叉菜膠誘發(fā)足浮腫的抑制作用。
實(shí)施例1調(diào)制的其他本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物也與上述化合物同樣具有角叉菜膠浮腫抑制作用。
實(shí)驗(yàn)例4在2μl用拓?fù)洚悩?gòu)酸酶II[TopoGEN公司制，2單位/μl]2μl、10倍濃度緩沖液
2μl、0.1％牛血清白蛋白(寶酒造公司制)2μl、蒸餾水11μl以及對照的蒸餾水或水與4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚調(diào)配成各種濃度的混合物中，加入1μl的0.25μg/μl pBR322 DNA(寶酒造公司制)，在37℃下反應(yīng)。反應(yīng)30分鐘后，添加1％月桂基硫酸鈉、50％甘油、0.02％溴苯基藍(lán)水溶液2μl，停止反應(yīng)。
在由瓊脂糖L03(寶酒造公司制)與TAE緩沖液[40mM Tris、5M醋酸鈉、1mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、用醋酸調(diào)整PH為7.8]制備的1％瓊脂糖凝膠上，加入20μl上述反應(yīng)液，在TAE緩沖液中進(jìn)行電泳。泳動(dòng)后，將凝膠浸入1μg/ml的溴化工チジゥム水溶液中，在紫外線照射下觀察DNA電泳模式。另外，在添加水的對照中DNA發(fā)生從超螺旋型到遲緩型的完全變化，但如阻礙拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性，則超螺旋型到遲緩型的變化部分或完全被阻礙。
結(jié)果表明，當(dāng)4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚在反應(yīng)液中的濃度達(dá)到250μM以上時(shí)表現(xiàn)出拓?fù)洚悩?gòu)酶的阻礙活性，在250μM時(shí)殘存有中等程度的超螺旋型DNA，在500μM時(shí)超螺旋型DNA占大半，在1000μM時(shí)超螺旋型DNA幾乎完全不減少。另外，4，5-二叔丁基環(huán)戊烯酮醚的旋光物與實(shí)施例1配制的其他的本發(fā)明化合物及其旋光物具有相同的活性。
以上本發(fā)明化合物僅對正常細(xì)胞分裂期稍有作用，但對由于細(xì)胞癌化在細(xì)胞整個(gè)分裂周期都高度存在的拓?fù)洚悩?gòu)酶II具有阻礙活性。
實(shí)施例5注射劑(1)在生理食鹽水(日本藥典收載品)中添加1％的4-芐基環(huán)戊烯酮醚或5-芐基環(huán)戊烯酮醚，制成注射劑。
(2)在生理食鹽水(與上述相同)中分別以0.5％和0.1％的濃度添加4-芐基環(huán)戊烯酮醚或者5-芐基環(huán)戊烯酮醚和甘草酸，制成注射劑。
實(shí)施例6片劑(1)制備含有100mg的4-芐基環(huán)戊烯酮醚和適量微晶纖維素的片劑，包上糖衣，制成片劑。
(2)制備含有0.1mg的5-芐基環(huán)戊烯酮醚、10mg甘草酸二鉀和適量微結(jié)晶性纖維素的片劑，包上糖衣，制成片劑。
發(fā)明的效果本發(fā)明提供了具有抗癌作用、癌細(xì)胞增殖抑制活性、細(xì)胞凋亡誘發(fā)作用等生理活性的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽以及它們的制造方法。使用本發(fā)明得到的化合物作為有效成分的藥物可以維持生物體的恒常狀態(tài)，是非常有用的藥品。
權(quán)利要求
1.由下列通式[I]表示的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽，
式中，R1和R2是相同或不同的直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、芳基或芳脂族基或H，但不包括R1＝R2＝H、或R1＝芐基時(shí)R2＝H的情況。
2.由通式[II]表示的環(huán)戊烯酮衍生物的制造方法，其特征是，使由下列式[III]表示的4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和/或其旋光物與相當(dāng)于由下列通式[II]表示的環(huán)戊烯酮衍生物的R3和R4的醇和/或其反應(yīng)性衍生物同時(shí)或依次反應(yīng)，
式中，R3和R4是相同或不同的直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈鏈烯基、芳基、芳脂族基或H，但不包括R3＝R4＝H的情況；
3.藥物，其特征是，含有選自權(quán)利要求1記載的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽中的至少一種化合物作為有效成分。
4.權(quán)利要求3所述的藥物，其中，所述的藥物是抗癌藥。
5.權(quán)利要求3所述的藥物，其中，所述的藥物是細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑。
6.藥物，其特征是，含有選自由權(quán)利要求2記載的方法得到的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽中的至少一種化合物作為有效成分。
7.權(quán)利要求6所述的藥物，其中，所述的藥物是抗癌劑。
8.權(quán)利要求6所述的藥物，其中，所述的藥物是細(xì)胞凋亡誘發(fā)劑。
全文摘要
由下列通式(Ⅰ)表示的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光物或者它們的鹽,式中,R
文檔編號C07C49/753GK1261342SQ98806456
公開日2000年7月26日 申請日期1998年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月30日
發(fā)明者小林英二, 小山信人, 加藤郁之進(jìn), 稻見薰, 芝哲夫 申請人:寶酒造株式會(huì)社