專利名稱：用于體內(nèi)轉(zhuǎn)化皮質(zhì)甾類前體藥物的催化性單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及名稱為“抗體酶”的催化性單克隆抗體，其可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)化皮質(zhì)甾類前體藥物，還涉及所述抗體在制備用于治療急性腎上腺皮質(zhì)功能不全的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明也涉及用于制備所述抗體酶的方法。
背景技術(shù)：
急性腎上腺皮質(zhì)功能不全是非常危險的病癥，并且經(jīng)常具有致命的后果。它可以在膿毒癥，急性氣喘危象，創(chuàng)傷，手術(shù)，血容量減少病癥和燒傷后的休克和虛脫狀態(tài)，心肌梗塞，肺栓塞，嚴(yán)重的水腫狀態(tài)(血管神經(jīng)性水腫，聲門水腫，肺水腫)，急性胰腺炎，血清注射后的過敏性反應(yīng)，轉(zhuǎn)輸意外，藥物過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的變應(yīng)性反應(yīng)，中風(fēng)，兒童期急性中毒和意外的中毒，肝炎和肝昏迷，甲狀腺毒性和艾迪生危象，閉塞性血栓脈管炎。
目前使用的治療方法包括用高劑量的皮質(zhì)甾類靜脈治療。但是，皮質(zhì)甾類在這樣的治療用途中的臨床應(yīng)用還沒有被合適的臨床研究證實，相反，絕大部分的臨床試驗沒有給出清楚的功效結(jié)果。所使用的產(chǎn)品的藥物動力學(xué)特性可以決定這種不確定性，另一方面這既不能歸因于方法學(xué)的誤差也不能歸因于在所述的療法中來自類固醇的藥理學(xué)活性的缺乏。由于皮質(zhì)甾類是水不溶性的，它們必須與親水載體綴合，以便可以將它們注射。但是，它們的生物學(xué)活性只有在分離親水部分之后才能保持，從而釋放皮質(zhì)甾類，以這種方式，它們可以穿過細(xì)胞膜并且結(jié)合到胞質(zhì)受體上?？傻乃煞肿雍陀H水部分之間的鍵的體內(nèi)斷裂是非常慢的，因為該分子是中等穩(wěn)定性的，并且在血流中不存在特異性酯酶。因此，活性成分的生物利用率不是立即的，并且只有在幾個小時之后才能觀察到治療應(yīng)答，導(dǎo)致患者生存的危險性。
皮質(zhì)甾類仍然是治療需要應(yīng)急措施的急性綜合癥的可選擇的藥物，盡管其作用機(jī)理目前還沒有被完全澄清并且尚未獲得對其功效的他覺查明的對照研究。類似于急性腎上腺皮質(zhì)功能不全，過敏性休克，血容量減少休克和心源性休克，喉水腫和其它病狀的情形通常用高劑量的可的松藥物(500毫克到10克)通過靜脈途徑治療，并且在24小時過程中每隔1-2小時重復(fù)給藥，直到患者產(chǎn)生臨床應(yīng)答。在危象之后的幾天進(jìn)一步以較低劑量將該治療延長，直到達(dá)到癥狀的控制和生命參數(shù)的恢復(fù)。隨后，以低劑量維持治療通常是必要的，甚至通過口服途徑。而且，眾所周知，也可以將皮質(zhì)甾類廣泛地用于治療退化，炎性和瘤形成類型的亞急性和慢性疾病，例如腎小球性腎炎，腎改變，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性心肌炎，支氣管哮喘，變應(yīng)性疾病，腸道和肝臟疾病，真皮改變，淋巴瘤，霍奇金疾病，心包炎，天皰瘡，紅皮病和其它病癥。在這些病例中延長治療和高劑量對于在作用位點(diǎn)獲得活性成分的合適的濃度也是必要的，結(jié)果導(dǎo)致皮質(zhì)甾類典型的副作用。
在延長治療之后產(chǎn)生的不利影響主要包括對腦垂體和腎上腺功能的抑制，氫的和電解的體內(nèi)平衡的紊亂，高血壓，高血糖，糖尿，對感染的增強(qiáng)的敏感性，骨質(zhì)疏松癥和神經(jīng)病。已經(jīng)證實這樣的不良反應(yīng)是由于藥物內(nèi)在的活性，但是皮質(zhì)甾類的動力學(xué)特性也對整個副反應(yīng)有強(qiáng)烈的影響。成為這些特性使得這樣的治療方案強(qiáng)制性的，如下文解釋的。
現(xiàn)有技術(shù)為了克服用皮質(zhì)甾類進(jìn)行應(yīng)急治療的缺陷，已經(jīng)嘗試了幾種治療方案，例如針對敗血癥性休克。為了調(diào)節(jié)急性全身性炎癥，已經(jīng)使用了阻止細(xì)胞因子類型的炎癥介質(zhì)或滅活內(nèi)毒素的單克隆抗體。但是，在急性過程中牽涉到的這些分子是特別多的和豐富的，僅僅選擇性抑制這些分子中的一個或一些在治療上是不夠的，因此已經(jīng)放棄了所述的治療方案。用于澄清糖皮質(zhì)激素的作用機(jī)制的最近的藥理學(xué)研究顯示通過刺激或抑制DNA轉(zhuǎn)錄而抑制炎性過程的不同方面(細(xì)胞因子，氧化氮，前列腺素，白三烯的產(chǎn)生，粘著分子在細(xì)胞表面的表達(dá)等等)，這些藥物通過與它們的特異性胞質(zhì)受體的相互作用能夠控制炎癥。根據(jù)這些結(jié)果，皮質(zhì)甾類在應(yīng)急治療中的使用有待重新估價。另一方面，這類藥物的一些特性，特別是結(jié)構(gòu)特性不允許充分利用其真正的治療能力，并且由于該理由其臨床療效仍然值得懷疑。
眾所周知，為了產(chǎn)生其特有的作用，藥物必須在其作用位點(diǎn)達(dá)到合適的濃度，所述的濃度取決于給藥的產(chǎn)品的量和該物質(zhì)的吸收程度和其它動力學(xué)參數(shù)。特別是吸收過程受例如分子的形式和尺寸，離子化程度，在親脂溶劑中的溶解性等因素的影響。
就皮質(zhì)甾類而言，它們是親脂分子，因此它們必須穿過細(xì)胞膜并且結(jié)合到其胞質(zhì)受體上以便利用其藥理學(xué)活性。這一方面構(gòu)成了其治療應(yīng)用的主要問題。所述化合物的親脂性顯然阻礙了在含水溶劑中的溶解性，及其在血流中的擴(kuò)散，因此使它們在作用位點(diǎn)的利用率遭致?lián)p害。為了克服這個缺點(diǎn)，已經(jīng)通過共價鍵將該類分子綴合到特定的親水分子(載體)上，允許其溶解。例如，對于可的松，已經(jīng)用磷酸，硫酸，琥珀酸，半琥珀酸或乙酸，叔丁乙酸，丙酮化合物，雙乙酸，六丙酮基團(tuán)將位置11，17或21酯化。
不幸的是，如果一方面這個酯鍵使該物質(zhì)成為可溶的并且允許其給藥和在血液循環(huán)中擴(kuò)散，同時阻礙了其通過細(xì)胞膜。因此該產(chǎn)品只有在前體藥物的酯鍵斷裂并且釋放親脂活性成分之后才能利用其藥理學(xué)活性。另一方面，該生物體沒有能夠斷裂這種類型的鍵的酯酶，因此水解過程是非常緩慢的并且該活性成分的生物利用率同樣是不足的。很明顯，對于其中需要應(yīng)急治療作用的病狀，這樣的藥物動力學(xué)特性經(jīng)常產(chǎn)生負(fù)結(jié)果。
因此，需要具有某種形式的活性成分，所述成分可溶解于水性藥物制劑，例如注射制劑中，并且一旦在血流中，便能以親脂形式迅速得到利用以便快速穿過細(xì)胞膜并且發(fā)揮其自身的藥理學(xué)作用。
催化性單克隆抗體和其在活化前體藥物中的用途是熟知的，例如公開在化學(xué)文摘(114)610w，(119)210716q，(121)195943g和(122)28553d中。一般的方案是基于催化性單克隆抗體(抗體酶)的開發(fā)，該抗體可以針對模擬參加化學(xué)反應(yīng)的化合物的過渡態(tài)的分子結(jié)構(gòu)的半抗原而產(chǎn)生。在參加化學(xué)反應(yīng)的分子的起始和最終排列中存在其中構(gòu)成原子和所有分子的勢能達(dá)到最大值的中間體構(gòu)型。該構(gòu)型相應(yīng)于過渡態(tài)并且趨向于確保反應(yīng)的最終排列以便使勢能恢復(fù)到較低的水平。
抗皮質(zhì)甾類的抗體酶或其衍生物是未知的。
在抗體酶的制備中遇到的問題是要查明合適的半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
WO8910754公開了能夠斷裂酯鍵的催化性單克隆抗體，并且在任何情況下都可以體內(nèi)活化前體藥物。在這篇現(xiàn)有技術(shù)中所提供的教導(dǎo)旨在解決激活或滅活肽類生物分子的問題，并且提供一系列的肽類半抗原。
WO9302703具體地涉及抗腫瘤治療，其中皮質(zhì)甾類是以前沒有預(yù)見的。
WO9416734涉及一種治療方法，其中通過一種復(fù)合結(jié)構(gòu)將效應(yīng)分子中的藥物釋放到預(yù)定的細(xì)胞位點(diǎn)，所述的結(jié)構(gòu)提供了連接到細(xì)胞位點(diǎn)上的第一種反應(yīng)劑，以擴(kuò)增的模式連接到所述的第一種反應(yīng)劑上的第二種反應(yīng)劑，效應(yīng)分子又連接到所述的第二種反應(yīng)劑上，此后釋放活性組分。這些反應(yīng)劑具有抗體作為形成不同鍵的官能團(tuán)，但是也可以把它們比作抗體。該效應(yīng)分子可以是藥物并且可以連接到載體分子，例如蛋白質(zhì)上。該藥物也可以是前體藥物，因為也提供了釋放活性部分的酶促劑；或該效應(yīng)分子可以是催化前體藥物轉(zhuǎn)化的酶。
活性組分的選擇性釋放出現(xiàn)在受體位點(diǎn)或其附近，并且在任何情況下都有將活性藥物引導(dǎo)到作用位點(diǎn)的作用。該具體教導(dǎo)針對在腫瘤的診斷或治療中的有效的引導(dǎo)分子。
JP94220072公開了抗抗生素的抗體酶。
在設(shè)計對完整的一類藥物，而不是對單個的化合物有效的過渡態(tài)的合適的同系物需要具有唯一的標(biāo)準(zhǔn)。而且，也需要具有這樣的同系物，不依賴于綴合到甾類分子上的親水部分。
具體的問題在于在可的松前體藥物中酯功能的快速水解，因為在生物體中不存在能夠釋放所討論的藥物的特異性酯酶。關(guān)于獲得抗酯形式的前體藥物的抗體酶的問題的一般性術(shù)語都包括在現(xiàn)有技術(shù)中膦酸功能被指明為模擬過渡態(tài)，也描述了與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)的基團(tuán)。但是，沒有對本領(lǐng)域的技術(shù)人員指明關(guān)于怎樣將偶聯(lián)基團(tuán)定位到甾類分子和其中與過渡態(tài)的模擬基團(tuán)的關(guān)系這樣的關(guān)鍵問題。
因此，所使用的半抗原的類型是非常關(guān)鍵的，并且過渡態(tài)的偶聯(lián)和模擬基團(tuán)的相互位置是更關(guān)鍵的。
WO8910754除了提到一般性的計算機(jī)模擬技術(shù)，特別是詳細(xì)地講了某些蛋白質(zhì)，例如人腎素，HIV gp120被膜蛋白的選定的肽鍵的斷裂。
WO9302703論述了免疫抑制，抗病毒，抗腫瘤和細(xì)胞毒性劑的前體藥物的具體問題，選擇酯化藥物的部分以便保護(hù)可能的前體藥物免受內(nèi)源性酯酶的破壞，并且僅在隨后，一旦已經(jīng)達(dá)到了合適的治療水平，便釋放活性成分。在某一方面，技術(shù)問題是本發(fā)明所解決的問題的反面，其中水解必須在最短的可能的時間內(nèi)完成，因為必須在應(yīng)急治療方法中，而不是在慢性治療起作用。
發(fā)明摘要現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)適合于生產(chǎn)抗皮質(zhì)甾類水溶性前體藥物的抗體酶的半抗原是在羥基上攜帶磷酸基團(tuán)的甾類結(jié)構(gòu)的化合物，所述的基團(tuán)在相應(yīng)的皮質(zhì)甾類中綴合到親水載體上，和在甾類骨架的位置C-3上攜帶適合于與大分子綴合的化學(xué)基團(tuán)，所述的化學(xué)基團(tuán)是離所述的磷酸基團(tuán)可能最遠(yuǎn)的。
因此，本發(fā)明的目的之一是通式(I)的化合物R-[A]-OR-PO3X2(I)其中A是皮質(zhì)甾類激素的甾類核；R是連接到孕烷環(huán)A的C-3位上的化學(xué)基團(tuán)并且適合于與免疫原大分子綴合；PO3X2是連接到21-或17-位置的羥基上的磷酸基團(tuán)(其在相應(yīng)的皮質(zhì)甾類激素上攜帶親水分子)；X是氫或藥物上可接受的陽離子。
通過R與適合于在動物中產(chǎn)生抗體應(yīng)答的分子適當(dāng)?shù)鼐Y合的通式(I)的化合物構(gòu)成了半抗原，從該半抗原將得到特異性抗皮質(zhì)甾類的不同水溶性前體藥物的催化性單克隆抗體(抗體酶)。
所述的抗體酶或其片段或其工程化的片段是本發(fā)明的另一個目的。
本發(fā)明的另一個目的是抗體酶對于制備適用于治療急性腎上腺皮質(zhì)功能不全的藥物的應(yīng)用。
由于活性成分的較高的生物利用率由本發(fā)明所獲得的主要優(yōu)點(diǎn)在于獲得即時的治療效果的可能性，在應(yīng)急情況下，這將允許使所治療的患者成功地獲得較高存活率。
由于可即時獲得皮質(zhì)甾類的藥理學(xué)作用，所以有可能以低劑量使用。
由于活性成分的較高的生物利用率，使用較低劑量的可能性和減少治療時間的機(jī)會能使以上列出的慢性疾病得到有效的治療，以避免副作用。
本發(fā)明的這些和其它的目的將借助于實施例進(jìn)行更詳細(xì)的公開。
發(fā)明詳述在通式(I)的化合物中，(A)是天然的或合成的皮質(zhì)甾類的甾族核。
腎上腺皮質(zhì)激素的例子是皮質(zhì)醇，氟代可的松，去炎松，地塞米松，強(qiáng)的松，可的松和倍他米松。
適合于與免疫原大分子綴合的R化學(xué)基團(tuán)的例子是疊氮基，對-苯偶氮基-β-D-乳糖苷(Lac)，對-苯偶氮基-β-D-葡糖苷(Glu)，對-苯偶氮基-胂酸鹽(Ars)，三硝基苯磺酸鈉(TNBS)，二硝基苯磺酸鈉(DNBS)，二硝基苯基(DNP)和S-乙酰-巰基琥珀酸酐。其中，疊氮基團(tuán)是優(yōu)選的。
水溶性皮質(zhì)甾類前體藥物的例子是用于注射制劑中的那些。優(yōu)選的例子是倍他米松磷酸鈉，倍他米松磷酸鈉和乙酸鈉，乙酸可的松，皮質(zhì)醇磷酸鈉，皮質(zhì)醇琥珀酸鈉，乙酸可的松，乙酸地塞米松，地塞米松磷酸鈉，乙酸強(qiáng)的松，甲基強(qiáng)的松琥珀酸鈉，乙酸強(qiáng)的松，強(qiáng)的松磷酸鈉，叔丁乙酸強(qiáng)的松，氟羥脫氫皮質(zhì)醇丙酮化合物，二乙酸氟羥脫氫皮質(zhì)醇，氟羥脫氫皮質(zhì)醇六丙酮化合物。21-半琥珀酸皮質(zhì)醇，21-乙酸皮質(zhì)醇，21-磷酸皮質(zhì)醇，17-半琥珀酸皮質(zhì)醇，17-乙酸皮質(zhì)醇，17-磷酸皮質(zhì)醇是更優(yōu)選的實施例。
從各個活性成分，即，從藥理學(xué)活性的甾類或其商品衍生物開始制備通式(I)的化合物。例如，在需要的位置已經(jīng)攜帶磷酸酯基團(tuán)的活性成分是商品或可以從熟知的方法制備。然后，根據(jù)文獻(xiàn)描述的常規(guī)方法插入選定的R基團(tuán)。
一旦獲得了通式(I)的化合物(半抗原)，將它與免疫原大分子綴合。這樣的大分子的例子是KLH，BSA，卵白蛋白，甲狀腺球蛋白，雞IG，多糖。
然后將半抗原-載體綴合物用于免疫接種動物，利用常規(guī)方法從該動物獲得催化性單克隆抗體(抗體酶)。
本發(fā)明的目的之一是抗皮質(zhì)甾類激素的水溶性前體藥物的抗體酶或其片段或其工程化片段。
通常，將免疫接種動物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合，在選擇雜交瘤和陽性克隆之后，純化抗體酶。
用于獲得抗體酶的程序不是關(guān)鍵的并且對于選擇動物，免疫接種方案，特定的骨髓瘤細(xì)胞系(或其它無限增殖化細(xì)胞)沒有特別的限制。
本發(fā)明的抗體酶的純化方法絕對是常規(guī)的并且在本領(lǐng)域技術(shù)人員的正常能動性范圍內(nèi)。
本發(fā)明的第一個優(yōu)選的實施方案涉及在位置21取代的可的松半抗原。它是化合物21β，17α-21-三羥基-4-孕烯-20-酮-3-亞肼基-4’-疊氮苯甲酰胺-21-磷酸酯，也就是通式(I)的化合物，其中(A)是可的松的甾族組分，R是3-亞肼基-4’-疊氮苯甲酰胺基團(tuán)，X
該化合物構(gòu)成了半抗原。
可以觀察到用作為半抗原的化合物的分子結(jié)構(gòu)不具有對應(yīng)于可的松的任何前體藥物的親水部分的側(cè)鏈。代替對于每個現(xiàn)存的可的松前體藥物合成過渡態(tài)的類似物，本發(fā)明允許對于每個確定的活性成分提供不依賴于親水殘基的每種前體藥物的斷裂反應(yīng)的過渡態(tài)的類似物。
因此，該抗體將識別由除了甾族組分以外的斷裂點(diǎn)代表的分子的部分，而可以是半琥珀酸鹽，磷酸鹽或其它熟知的載體之一的親水部分不太重要。根據(jù)相同的原理，也可以將其它可的松衍生物用作為治療劑，例如不同于可的松的甲基強(qiáng)的松，其在位置6-α存在甲基基團(tuán)，只有當(dāng)連接到半琥珀酸殘基(半琥珀酸強(qiáng)的松，URBASON(R)SOLUBILE，8，20，40，250毫克)時才能用于注射制劑。
對于半抗原分子，磷酸基團(tuán)存在于-21位置，模擬酯基團(tuán)的水解的過渡態(tài)，是在空間上與四元碳類似的。
打算用于與載體蛋白建立鍵的基團(tuán)連接到位置3，在該分子中它代表與位置21或17最遠(yuǎn)的碳原子，其上存在親水取代基。
根據(jù)本發(fā)明，催化性抗體能夠識別靠近反應(yīng)中心的甾族分子的重要部分。事實上，將大分子載體連接到位置C3的疊氮化物上，使得分子的該組分可用于免疫識別，其中反應(yīng)必須真正發(fā)生。于是，所激發(fā)的抗體便可識別C21的結(jié)合位點(diǎn)和甾類分子的主要部分。
通過將商品二氫可的松-21-磷酸酯與4-疊氮苯甲酸的酰肼縮合已經(jīng)獲得了半抗原；已經(jīng)從4-氨基苯甲酸開始通過下面的反應(yīng)步驟制備了后一化合物與水中的硝酸重氮酸化，隨后與氮化鈉反應(yīng)以獲得4-疊氮苯甲酸；后者用鹽酸甲醇酯化；在中間體甲基酯的甲醇中進(jìn)行肼解反應(yīng)。通過在密閉管瓶中將溶于甲醇(3毫升)的等摩爾量(2毫摩爾)的反應(yīng)劑加熱到90℃，3小時進(jìn)行半抗原與二氫可的松-21-磷酸酯的縮合，直到獲得澄清的溶液，通過溶劑蒸發(fā)將半抗原以固體形式從中分離出來。根據(jù)在RMN光譜上連接到C-4上的乙烯基信號的移動推斷出在反應(yīng)混合物中半抗原的存在。
由于其低分子量，作為類似物合成的分子缺乏免疫原能力，而所說的免疫原能力是當(dāng)它們與大分子載體綴合時獲得的。在通常的實驗條件下，更經(jīng)常使用的分子載體是蛋白質(zhì)。于是，將修飾的甾類(半抗原)綴合到蛋白質(zhì)上以便保證需要的分子區(qū)(抗原決定簇)的最大的顯露已成為必需的。在優(yōu)選的實施方案中，KLH是選定的蛋白質(zhì)。
綴合到大分子載體上的模式取決于在半抗原分子上可利用的官能團(tuán)的類型。用半抗原化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的不同方法是可獲得的，并且一般可以使用，然后選擇最有效的。通過吸收分光光度法估測取代的摩爾比。
根據(jù)不同的治療方案，通過皮下注射途徑(與完全和不完全弗氏佐劑)和通過腹膜內(nèi)途徑，將半抗原-蛋白質(zhì)載體綴合物用于免疫接種8-10周齡的Balb/c小鼠。
在治療期結(jié)束時，抽取動物的血清以驗證產(chǎn)生了針對抗原的免疫應(yīng)答，然后產(chǎn)生需要的催化活性。
一旦選擇了產(chǎn)生較高抗體應(yīng)答的動物，根據(jù)常規(guī)的方法進(jìn)行單克隆抗體的制備(將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，通過下文公開的放射性測定方法篩選雜交瘤家族，選擇陽性克隆，純化抗體)。
為了使催化性抗體的效力最大化，可以采取不同的策略進(jìn)行-修飾過渡態(tài)的類似物；-從在噬菌體上表達(dá)的合并文庫選擇抗體(噬菌體顯示)；-借助于位點(diǎn)特異性誘變修飾以前用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的催化性單克隆抗體。
本發(fā)明的抗體酶具有抗皮質(zhì)甾類激素的水溶性前體藥物的催化活性，因此它們可用于治療腎上腺皮質(zhì)功能不全，特別是應(yīng)急治療，其中該藥物的最快的作用是必需的。
因此，本發(fā)明的目的之一是抗皮質(zhì)甾類激素的水溶性前體藥物的抗體酶對于制備用于治療用可的松藥物可治愈的病狀的藥物的應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明的應(yīng)用包括在治療急性腎上腺皮質(zhì)功能不全，膿毒癥，急性氣喘危象，創(chuàng)傷，手術(shù)，血容量減少病癥和燒傷后的休克和虛脫狀態(tài)，心肌梗塞，肺栓塞，嚴(yán)重的水腫狀態(tài)(血管神經(jīng)性水腫，聲門水腫，肺水腫)，急性胰腺炎，血清注射后的過敏性反應(yīng)，轉(zhuǎn)輸意外，藥物過敏反應(yīng)，嚴(yán)重的變應(yīng)性反應(yīng)，中風(fēng)，兒童期急性中毒和意外的中毒，肝炎和肝昏迷，甲狀腺毒性和艾迪生危象，閉塞性血栓脈管炎中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個目的是抗皮質(zhì)甾類激素的水溶性前體藥物的抗體酶對于制備用于治療退化，炎性和瘤形成類型的亞急性和慢性疾病，例如腎小球性腎炎，腎改變，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性心肌炎，支氣管哮喘，變應(yīng)性疾病，腸道和肝臟疾病，真皮改變，淋巴瘤，霍奇金疾病，心包炎，天皰瘡，紅皮病和其它病癥的藥物的應(yīng)用。
抗體酶的給藥將由主治醫(yī)生根據(jù)病狀的類型，患者的狀態(tài)和有關(guān)的前體藥物的類型確定次數(shù)和劑量。
本發(fā)明的抗體酶可以與相應(yīng)的前體藥物同時給藥或以由有經(jīng)驗的醫(yī)生確立的一定的順序給藥。
方便的是，將本發(fā)明的抗體酶配制為藥物組合物，所述的組合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該組合物含有有效量的抗體酶，該有效量根據(jù)所述前體藥物的比活性來確定。
本發(fā)明的組合物含有與藥物上可接受載體和賦形劑混合的抗體酶，并且可以以熟知的方法例如在Remington’s藥物科學(xué)手冊(美國紐約Mack出版社出版)中描述的方法制備。
可注射的組合物是優(yōu)選的。
本發(fā)明也包括藥盒，它以分離的形式含有一種包括合適量的本發(fā)明的抗體酶的藥物組合物和一種包括藥物上有效量的(對抗體酶而言)皮質(zhì)甾類的水溶性前體藥物的藥物組合物。
下面的實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施例a)半抗原21β，17α-21-三羥基-4-孕烯-20-酮-3-亞肼基-4’-疊氮苯甲酰胺-21-磷酸酯的制備通過將50毫克3-疊氮苯甲?；潞?50毫克的非純化的21-磷酸皮質(zhì)醇蒸發(fā)至干獲得標(biāo)題化合物。
b)與KLH綴合將20毫克KLH(六聚體，分子量450000克/摩爾)溶解于10mM碳酸氫鉀，pH7.4，5毫升至終濃度為4毫克/毫升。
將未純化的上述產(chǎn)物溶解于相同的溶液，計算出200摩爾過量的21-磷酸皮質(zhì)醇衍生物。計算出所使用產(chǎn)物的量，假設(shè)所有的甾類以活性的取代的疊氮形式存在
(考慮這樣的事實在起始的反應(yīng)混合物中有1份疊氮化物和3份21-磷酸皮質(zhì)醇，4/3用來校正質(zhì)量。
該溶液用未掩蔽的200W-汞蒸汽燈，用冷光，在攪拌條件下照射20分鐘。
將產(chǎn)物通過用相同的反應(yīng)緩沖液平衡的Sephadex G 50 Zim Δ 2厘米×5厘米。
通過測量體積收集(A280)峰值的餾份。為了預(yù)測每體積單位的磷酸酯的含量，假設(shè)獲得了最大摩爾取代比(200∶1)，并且借助于Ames測試以合適的體積和稀釋度估測磷酸酯的量。將Ames測試用于10微升的反應(yīng)KLH并且獲得A280＝0.981的值。
由于該測試的消光系數(shù)是A280＝0.240/0.01微摩爾的磷酸酯，所以結(jié)果為
其中取代摩爾比為[P][KLH]=3.28×10-3M5.55×10-6M=591]]>c)以綴合物免疫接種小鼠并控制抗體活性根據(jù)不同的治療方案，通過皮下注射途徑(與完全和不完全弗氏佐劑)和通過腹膜內(nèi)途徑，將半抗原-蛋白質(zhì)載體綴合物用于免疫接種8-10周齡的βalb/c小鼠。
在治療期結(jié)束時，抽取動物的血清以驗證產(chǎn)生了針對抗原的免疫應(yīng)答，然后產(chǎn)生需要的催化活性。
為了進(jìn)行這種控制，按照順序進(jìn)行特定的放射性測定從37Mbq的[1，2，6，7-3H]皮質(zhì)醇(Amersham)開始合成了用氚(3H-C21-H)標(biāo)記的[1，2，6，7-3H]-11β，17α-二羥基-4-孕烯-3，20-二酮-21半琥珀酸酯。
為了獲得具有ba60％的計數(shù)效率的50.000cpm的分析信號，體積為100微升的工作濃度如下
從理論上說可能標(biāo)記的質(zhì)量允許制備等同于
的工作溶液的體積。
由于以等同于10微摩爾濃度(從文獻(xiàn)獲得)的底物的真正濃度的工作是合適的，所以制備下列總量的底物是必要的2.664×10-6摩爾/升＝2.664×10-5摩爾由于標(biāo)記物的量等同于37×106bq/2.11×1015bq/摩爾＝1.7×10-8摩爾，其對總質(zhì)量的貢獻(xiàn)是可忽略的。
從2.664×10-5摩爾×362克/摩爾＝9.6×10-3克可獲得皮質(zhì)醇的分子量＝62.5克/摩爾的冷載體的量。
將此質(zhì)量的皮質(zhì)醇分配于反應(yīng)管瓶(React.Vial Pierce)中，其中標(biāo)記的溶劑已經(jīng)在T0(最大)30℃的氮?dú)饬飨抡舭l(fā)。
將皮質(zhì)醇溶解于200微升的無水吡啶，以便與具有三摩爾倍過量的琥珀酸酐的堿性催化劑反應(yīng)2.664×10-5摩爾×3×100.1克/摩爾＝8.0×10-3克將反應(yīng)混合物在恒定攪拌的條件下在室溫下放置15小時。
在保溫結(jié)束時，將該混合物轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，再用200微升吡啶洗滌反應(yīng)管瓶。
用400微升的鹽酸37％使吡啶固化。在用水稀釋之后，用乙酸乙酯提取(3次)。
以這種方式，可以獲得標(biāo)記的皮質(zhì)醇，蒸發(fā)獲得需要的產(chǎn)物的結(jié)晶。
在制備標(biāo)記的反應(yīng)底物之后，建立了放射性酶促測定。
該方法基于冷的琥珀酸組分從氚化皮質(zhì)醇的核上除去之后溶解度的變化。在將底物與反應(yīng)基質(zhì)(緩沖液，克隆的上清液或整個人血清)接觸保溫之后，水相用乙醚提取，隨后進(jìn)行溶劑的蒸發(fā)和在3H皮質(zhì)醇發(fā)出的放射性信號的提取物中的測量。通過在其熔點(diǎn)用蒸餾水跳躍稀釋(16×)在需要的時刻終止保溫。如果催化速度依賴于催化劑濃度和溫度，并且考慮保溫在38.5℃(相應(yīng)于人體內(nèi)部溫度)下進(jìn)行，該程序允許反應(yīng)速度降低16×24倍(記住T每降低10℃，AE＝20hJ/摩爾，速度)，因此可被認(rèn)為是令人滿意的。
通過渦旋10秒進(jìn)行用乙醚的提取。在提取期間，在如此有限的時間內(nèi)允許反應(yīng)在水相中仍處于失去平衡的狀態(tài)。
通過利用五個在不同的時間在人血清中保溫的底物的不同的摩爾濃度對該程序進(jìn)行限定。
與對照樣品相比，僅僅在底物濃度＞100mM和在高于1小時的保溫時間時檢測到人血清中的皮質(zhì)醇-21-半琥珀酸酯的自發(fā)的酯酶活性。
因此已經(jīng)將該方法用于鑒定免疫接種的動物，所述的動物產(chǎn)生了陽性免疫應(yīng)答，這是由于具有抗皮質(zhì)醇-21-半琥珀酸酯的酯酶活性的抗體的產(chǎn)生。在等同于10mM的底物濃度下和在保溫1小時之后進(jìn)行的該測定的結(jié)果給出了下列跡象在用半抗原-載體綴合物免疫接種的小鼠的血清中發(fā)現(xiàn)了高于未治療的動物和空白對照的血清中存在的活性的酯酶活性。
權(quán)利要求
1.抗皮質(zhì)甾類激素的水溶性前體藥物的抗體酶或其片段或其工程化的片段。
2.抗皮質(zhì)甾類激素的水溶性前體藥物的抗體酶，其可由包括下列步驟的方法獲得a)所述的前體藥物的過渡態(tài)的半抗原類似物與免疫原大分子綴合以產(chǎn)生綴合物，所述的半抗原具有通式(I)的結(jié)構(gòu)R-[A]-OR-PO3X2(I)其中A是皮質(zhì)甾類激素的甾類核；R是連接到孕烷環(huán)A的C-3位上并且適合于與免疫原大分子綴合的化學(xué)基團(tuán)；PO3X2是連接到21-或17-位置的羥基上的磷酸基團(tuán)(其在相應(yīng)的皮質(zhì)甾類激素上攜帶親水分子)；X是氫或藥物上可接受的陽離子；b)獲得抗所述綴合物的催化性單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體酶，其中所述的前體藥物是皮質(zhì)醇，氟代可的松，氟羥脫氫皮質(zhì)醇，地塞米松，強(qiáng)的松，可的松，倍他米松的水溶性衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗體酶，其中所述的前體藥物是皮質(zhì)醇的水溶性衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體酶，其中所述的前體藥物選自于下列組21-半琥珀酸皮質(zhì)醇，21-乙酸皮質(zhì)醇，21-磷酸皮質(zhì)醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體酶，其中所述的前體藥物選自于下列組17-半琥珀酸皮質(zhì)醇，17-乙酸皮質(zhì)醇，17-磷酸皮質(zhì)醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2-6任一項所述的抗體酶，其中所述的半抗原是化合物21β，17α-21-三羥基-4-孕烯-20-二酮-3-亞肼基-3’-疊氮苯甲酰胺-21-磷酸酯。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項所述的抗體酶，其中所述的大分子是蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體酶，其中所述的蛋白質(zhì)是KLH。
10.根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的的抗體酶，其中所述的單克隆抗體是通過以在步驟a)中獲得的所述的綴合物免疫接種動物獲得的。
11.根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的的抗體酶，其中所述的單克隆抗體是通過體外免疫接種獲得的。
12.權(quán)利要求1或2-10的抗體酶作為藥物的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求1或2-10的抗體酶對于制備可用于以皮質(zhì)醇藥物可治愈的治療方法的藥物的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求1或2-10的抗體酶對于制備治療急性腎上腺皮質(zhì)功能不全的藥物的應(yīng)用。
15.含有有效量的權(quán)利要求1或2-10的抗體酶與藥物上可接受載體和賦形劑混合的藥物組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，該組合物是可注射形式。
17.包括至少一種含有有效量的權(quán)利要求1或2-10的抗體酶與藥物上可接受載體和賦形劑混合的藥物組合物和另一種藥物組合物的試劑盒，后一組合物含有對抗體酶的量而言有效量的皮質(zhì)甾類激素的水溶性前體藥物。
18.通式(I)的化合物R-[A]-O-PO3X2(I)其中A是皮質(zhì)甾類激素的甾類核；R是連接到孕烷環(huán)A的C-3位上并且適合于與免疫原大分子綴合的化學(xué)基團(tuán)；PO3X2是連接到21-或17-位置的羥基上的磷酸基團(tuán)(其在相應(yīng)的皮質(zhì)甾類激素上攜帶親水分子)；X是氫或藥物上可接受的陽離子。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的化合物，該化合物是11β，17α-21-三羥基-4-孕烯-20-二酮-3-亞肼基-3’-疊氮苯甲酰胺-21-磷酸酯。
20.權(quán)利要求18或19的化合物在制備權(quán)利要求1或2-10的抗體酶中作為半抗原的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于體內(nèi)轉(zhuǎn)化皮質(zhì)甾類前體藥物的催化性單克隆抗體(抗體酶)。這些抗體酶有利地用于急性腎上腺皮質(zhì)功能不全的應(yīng)急治療,以便促進(jìn)皮質(zhì)甾類的藥理學(xué)作用。還公開了產(chǎn)生抗體酶的半抗原。
文檔編號C07J51/00GK1268174SQ98808387
公開日2000年9月27日 申請日期1998年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月30日
發(fā)明者A·潑德斯塔, S·特拉斯西亞蒂, S·羅斯尼 申請人:埃比奧吉恩藥物股份公司