專利名稱：用于自身免疫疾病的免疫療法中的新型肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型肽、其在治療自身免疫疾病中關(guān)節(jié)軟骨慢性損傷中的用途、含有所述肽的藥物組合物、以及檢測試樣中自體反應(yīng)性T細(xì)胞的診斷方法。
免疫系統(tǒng)是建立在外來抗原(非自身抗原)和自身抗原(來自個體自己身體的自體抗原)之間通過抗自身抗原的固定耐性實(shí)現(xiàn)辨別的原理上的。
免疫系統(tǒng)保護(hù)個體抵抗外來抗原，并通過激活特異細(xì)胞如T-和B淋巴細(xì)胞和產(chǎn)生可溶性因子類白介素、抗體和補(bǔ)體因子響應(yīng)外來抗原的接觸。免疫系統(tǒng)響應(yīng)的抗原通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)降解，并且該抗原的片段在伴有主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅱ型糖蛋白的細(xì)胞表面上表達(dá)。憑借其T細(xì)胞受體識別與結(jié)合其上的MHCⅡ型蛋白質(zhì)相連的抗原片段，將該MHC-糖蛋白-抗原-片段復(fù)合物呈遞到T細(xì)胞上。該T細(xì)胞被激活，即繁殖和/或產(chǎn)生白介素，使得介導(dǎo)到受到攻擊的抗原上的活化淋巴細(xì)胞擴(kuò)展(Grey等人，Sci.,Am.,261:38-46,1989)。
自身抗原也被連續(xù)加工并通過MHC糖蛋白以抗原片段呈遞到T細(xì)胞上(Jardetsky等人，自然353:326-329,1991)。因此自身識別是免疫系統(tǒng)所固有的。在正常情況下，免疫系統(tǒng)耐自身抗原，并且避免了通過這些自身抗原激活免疫反應(yīng)。
當(dāng)自身抗原耐性喪失時，免疫系統(tǒng)可能被一種或多種自身抗原激活，這使得激活自體反應(yīng)性T細(xì)胞并產(chǎn)生自體抗體。這種現(xiàn)象被稱之為自身免疫。由于免疫反應(yīng)通常是破壞性的，即意味著破壞侵襲性外來抗原，自身免疫反應(yīng)可能造成身體自身組織的破壞。
T細(xì)胞對自身免疫疾病的貢獻(xiàn)建立在幾個研究中。在小鼠中，試驗(yàn)自身免疫腦脊髓炎(EAE)通過T細(xì)胞的高度限制性基團(tuán)介導(dǎo)，通過對復(fù)合到MHCⅡ型分子上的髓鞘堿性蛋白(MBP)的單個表位的特異性相連。在Lewis大鼠中，對各種自身免疫疾病的敏感性高的種，已顯示疾病是通過T細(xì)胞介導(dǎo)的。在人自身免疫疾病中，還認(rèn)為與自侵T細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)。
破壞性自身免疫反應(yīng)已涉及到如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的各種疾病，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)軟骨的整體性被慢性炎性過程破壞，這導(dǎo)致出現(xiàn)大量激活的淋巴細(xì)胞和表達(dá)MHCⅡ型的細(xì)胞。軟骨中存在的節(jié)看起來必需承受局部炎癥反應(yīng)它已暗示軟骨降解與軟骨反應(yīng)的自身反應(yīng)性T細(xì)胞在RA中的活性有關(guān)(Sigall等人的Clin.Exp.Rheumat.6:59,1988；Glant等人的Biochem.Soc.Trans.18:796,1990；Burmester等人的Rheumatoid arthritis Smolen,Kalden,Maini(編輯)Springer-VerlagBerlin Heidelberg,1992)。而且，通過手術(shù)將軟骨從RA患者中除去顯示減輕了炎性過程(R.S.Laskin,J.Bone Joint Surgery(Am)72:529,1990)。因此軟骨蛋白被認(rèn)為是勝任刺激T細(xì)胞的靶自身抗原。這些自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化導(dǎo)致自身免疫疾病形成。但是，起類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)作作用的自身抗原性組分的鑒定至今為止仍然難以捉摸。
導(dǎo)致軟骨破壞的炎癥反應(yīng)可以通過幾種藥物治療，例如類固醇藥。但是，這些藥物經(jīng)常為免疫抑制性藥物，它為非特異性且具有毒性副作用。非特異性免疫抑制的缺陷使其對治療非常不利。
抗原特異性、非毒性免疫抑制療法提供了一種非常吸引人的非特異性免疫抑制的替代。該抗原特異性療法包括用靶自身抗原或者用來自該自身抗原的合成-T細(xì)胞反應(yīng)性肽治療患者。這些合成肽相應(yīng)于該自身抗原的T細(xì)胞肽。盡管用引起激活免疫系統(tǒng)的非常相同的抗原脫敏該免疫系統(tǒng)看起來是矛盾的，但是在免疫系統(tǒng)脫敏時控制地給藥該靶(自身)抗原可能是非常有效的。免疫系統(tǒng)的脫敏或免疫耐性是基于長期觀察的現(xiàn)象，當(dāng)通過全身途徑導(dǎo)入所述抗原或肽時，被飼養(yǎng)或吸入抗原或肽的動物很少能向所述抗原或表位產(chǎn)生全身性免疫反應(yīng)。
以前在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中以靶自身抗原鑒定了人軟骨糖蛋白-39(HC gp-39)(Verheijden等人，Arthitis Rheum.40:1115-1125,1997)。用于鑒定HC gp-39中相關(guān)自身表位所遵循的策略是基于以下假設(shè)DR4或DR1分子以兩種水平易患RA(Gao等人，Arthitis Rheum.33:939-946,1990；Nelson等人的《類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎》，在第7屆國際組織相容性研討和協(xié)商會的會議錄中，第1卷，Tsuji等人編輯，牛津大學(xué)出版社，1991)首先，通過形成T細(xì)胞所有組成部分，其次，通過決定簇選擇。在伴有RA的DR分子中發(fā)現(xiàn)的共享表位可能涉及到用于呈遞T細(xì)胞的肽的相似組的選擇(Gregerson等人，Arthitis Rheum.30:1205-1213,1987)。通過使用DR4(B1*0401)肽結(jié)合基序鑒定在HC gp-39的一級結(jié)構(gòu)中的推定的結(jié)合序列(Verheijden等人，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎40:1115-1125,1997)。HCgp-39，一種具有362個氨基酸的蛋白質(zhì)，不包括信號序列(Hakala等人，生物學(xué)化學(xué)雜志268:25803-25810,1993)，含有6個調(diào)節(jié)該基序的區(qū)域。合成這樣選擇的4個肽，并測定其結(jié)合伴有RA的DR1和DR4(B1*0401和0404)變異體。發(fā)現(xiàn)所有以基序?yàn)榛A(chǔ)的肽、跨越HC gp-39的殘基103-116、259-275、263-275和326-338、以相當(dāng)高的親和性結(jié)合到DRB1*0401分子上。之后測定這些肽通過來自RA患者和健康供體的周圍血液T細(xì)胞的識別。所有以基序?yàn)榛A(chǔ)的肽易于在RA患者中識別，由此暗示HC gp-39-特異性T細(xì)胞在RA中的頻率高。對263-275的反應(yīng)最顯著；18個RA患者中有8個對該肽有響應(yīng)(Verheijden等人，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎40:1115-1125,1997)。因此，HC gp-39為在關(guān)節(jié)中免疫識別的靶子。
通過Balb/c小鼠中的關(guān)節(jié)炎遺傳性還證實(shí)了該蛋白質(zhì)對關(guān)節(jié)炎疾病的重要性。在胸部區(qū)一次注射混合在IFA中的μg量的蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)RA的慢性關(guān)節(jié)炎癥回憶(Verheijden等人，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎40:1115-1125,1997)。
最近，分離并描述了新型人軟骨細(xì)胞蛋白，YKL-39(Hu等人，J.Biol.Chem.271:19415-19420,1996)。該蛋白質(zhì)與HC gp-39(YKL-40)具有明顯的序列相同性。HC gp-39的另一同源物通過人巨噬細(xì)胞分泌并被稱為殼三糖苷酶(Boot等人，J.Biol.Chem.270:26252-26256,1995)。相應(yīng)于HC gp-39(263-275)肽RSFTLASSETGVG的序列(SEQ ID NO:3)被鑒定分別為YKL-39蛋白質(zhì)(266-278)中的HSFTLASAETTVG(SEQ IDNO:2)和巨噬細(xì)胞殼三糖苷酶(269-282)中的RSFTLASSSDTRVG(SEQID NO:4)(表1)。
殼三糖苷酶肽Chi(269-282)含有以前用于選擇蛋白質(zhì)中T-細(xì)胞表位的DRB1*0401肽結(jié)合基序。與之相反，YKL-39(266-278)不含該0401基序。
很顯然，HC gp-39(263-275)-反應(yīng)性T-細(xì)胞的耐性可能是對RA患者有益的。同樣地，HC gp-39(263-275)的模擬表位可能具有相似功能并且可以用于誘導(dǎo)耐性。優(yōu)選這些模擬表位具有至少相同的耐受能力。
為了有效地使用耐性誘導(dǎo)療法治療T細(xì)胞介導(dǎo)的軟骨破壞，大量需要鑒定可以使抗正激活引起該炎癥過程的T細(xì)胞的自身抗原的患者脫敏的T細(xì)胞-反應(yīng)性肽。
盡管YKL-39肽不含該0401基序，但是出人意料地發(fā)現(xiàn)，該YKL-39(266-278)肽為HC gp-39(263-275)的模擬表位。因此該表位對耐受在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中對HC gp-39(263-275)、YKL-39(266-278)或其模擬表位具有反應(yīng)性的自身反應(yīng)性T-細(xì)胞有用。
本發(fā)明的目的是提供能夠誘導(dǎo)全身性免疫耐性，更具體地說特異性T細(xì)胞耐性的肽，優(yōu)選對遭受T細(xì)胞介導(dǎo)的軟骨破壞的患者中的響應(yīng)性軟骨抗原。本發(fā)明的肽的特征在于脫敏含有一個或多個氨基酸序列FTLASAETT(SEQ ID NO:1)。更具體地說，根據(jù)本發(fā)明的肽含有HSFTLASAETTVG(SEQ ID NO:2)。
根據(jù)本發(fā)明的肽的多聚體如根據(jù)本發(fā)明的肽的二聚體或三聚體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的多聚體或者可以為由多個相同肽組成的均聚物，或者可以為由不同肽組成的雜聚物。
根據(jù)本發(fā)明的肽的特征氨基酸序列兩側(cè)可以是隨機(jī)氨基酸序列。優(yōu)選為側(cè)翼序列，它們對這些肽具有穩(wěn)定作用，因此增加了其生物可利用率。
人軟骨糖蛋白39為RA患者中的靶自身抗原，它激活特異性T細(xì)胞，因此造成或介導(dǎo)炎癥過程。來自HC gp-39的肽主要被來自RA患者的自身反應(yīng)性T細(xì)胞識別，但很少被來自健康供體的T細(xì)胞識別，這說明HCgp-39為RA中的自身抗原。HC gp-39的關(guān)節(jié)炎遺傳性質(zhì)還在Balb/c小鼠中得到證實(shí)。在Balb/c小鼠中單獨(dú)、皮下注射所述蛋白質(zhì)能夠啟動動物中的關(guān)節(jié)炎信號。HC gp-39誘導(dǎo)的疾病過程通過在前爪和/或后爪中周期性地出現(xiàn)復(fù)發(fā)來鑒定并漸漸由輕微關(guān)節(jié)炎發(fā)展成較嚴(yán)重的形式。而且，觀察給人痛苦的關(guān)節(jié)的對稱分布，同時觀察關(guān)節(jié)炎，特別是RA的疾病進(jìn)程的復(fù)發(fā)、回憶。
出人意料地發(fā)現(xiàn)，YKL-39 266-278肽起耐受原的效果。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，很顯然，這些肽可以在肽的任一邊或在兩邊延伸并且仍然揮發(fā)相同的免疫功能。延伸部分可以是與蛋白質(zhì)YKL-39的天然序列相似的氨基酸序列。
本發(fā)明的肽可以通過肽合成的熟知的有機(jī)化學(xué)方法制備，如在美國化學(xué)家協(xié)會雜志85:2149(1963)和國際肽蛋白質(zhì)研究雜志35:161-214(1990)中所述的固相肽合成。本發(fā)明的肽還可以通過重組DNA技術(shù)制備。可以將編碼本發(fā)明肽或所述肽的多聚物的核酸序列插入表達(dá)載體中。適宜表達(dá)載體包括復(fù)制和表達(dá)的必需控制區(qū)?？梢允乖摫磉_(dá)載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)。適宜的宿主細(xì)胞例如有細(xì)菌、酵母細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。這些技術(shù)在本領(lǐng)域中為公知，參見例如Sambrooke等人的《分子克隆試驗(yàn)手則》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，1989。
這些肽可以通過C-和/或N-端修飾穩(wěn)定，這將降低外肽酶催化水解。這些修飾可以包括C-端?；?例如乙?；?Ac-肽)、N-端酰胺導(dǎo)入(例如肽-NH2)、酰化和酰胺導(dǎo)入的組合(例如Ac-肽-NH2)和導(dǎo)入D-氨基酸替代L-氨基酸(Powell等人，藥物科學(xué)雜志，81:731-735,1992)。
其它修飾集中在通過內(nèi)肽酶防止水解。這些修飾的例子有導(dǎo)入D-氨基酸替換L-氨基酸、修飾的氨基酸、在肽中環(huán)化、引入修飾的肽鍵如經(jīng)過還原的肽鍵φ[CH2NH]以及例如肽(N-烷基化甘氨酸衍生物)(Adang等人，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas,113:63-78,1994和Simon等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)，89:9367-9371,1992)。
根據(jù)本發(fā)明的肽為T-細(xì)胞表位，它通過自身反應(yīng)性T-細(xì)胞識別并能夠刺激自身反應(yīng)性T-細(xì)胞。這些自身反應(yīng)性T細(xì)胞例如可以在遭受自身免疫疾病的患者血液中發(fā)現(xiàn)。
因此，根據(jù)本發(fā)明，這些肽、與在含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的肽的靶自身抗原上出現(xiàn)的MHCⅡ型限制性T-細(xì)胞表位相似的所述肽，非常適宜用于一治療中，從而誘導(dǎo)特異性T-細(xì)胞對遭受T-細(xì)胞介導(dǎo)的軟骨破壞如關(guān)節(jié)炎，尤其是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的哺乳動物，尤其是人中的所述自身抗原的耐受性。任選地這些治療可以與施用其它藥物相結(jié)合，這些藥物例如有DMARD(緩和疾病的抗風(fēng)濕性藥物如柳氮磺胺吡啶、可注射或口服金的抗瘧藥(氯喹、羥氯喹)、甲氨蝶呤、D-青霉胺、硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素、霉酚酸鹽)NSAID(非甾族消炎藥)、皮質(zhì)類固醇或已知影響自身免疫患者中疾病過程的其它藥物。
還可以使用本發(fā)明的肽調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞，該淋巴細(xì)胞與除所述自身抗原之外的抗原反應(yīng)但存在于與該自身抗原即含有根據(jù)SEQ ID NO∶1或SEQID NO∶2的肽的蛋白質(zhì)或其部分相同的組織中。通過誘導(dǎo)抗原-特異性T-細(xì)胞耐性，可以通過旁觀者抑制治療自身免疫疾病。更一般的說，待調(diào)節(jié)的細(xì)胞為造血細(xì)胞。一般來說，為了起一耐受原的作用，該肽必需達(dá)到至少兩種條件，即它必需具有免疫調(diào)節(jié)能力并且它必需通常以較大蛋白質(zhì)部分局部地表達(dá)。
因此，本發(fā)明提供了一種通過給藥含有本發(fā)明的肽的藥物制劑治療遭受炎癥性自身免疫疾病的患者的方法。這些患者可能遭受如下疾病格雷夫斯氏病、青年期關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性腎小球性腎炎、骨關(guān)節(jié)炎、斯耶格倫氏病、重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿狄森氏病、原發(fā)性膽汁硬化癥、眼色素層炎、全身性紅斑狼瘡、炎性腸病、多發(fā)性硬化或糖尿病?？梢允褂帽景l(fā)明的肽制備誘導(dǎo)遭受這些疾病的患者中的耐性的藥物。
使用本發(fā)明的肽對自身免疫疾病的治療利用了如下事實(shí)對不相關(guān)但共定位的抗原誘導(dǎo)旁觀者抑制。調(diào)節(jié)細(xì)胞以抗原特異性形式分泌多向性蛋白質(zhì)，例如可以負(fù)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子。
根據(jù)本發(fā)明，可以使用含有本發(fā)明的一種或多種肽和藥用上可接受的載體的藥物組合物治療自身關(guān)節(jié)軟骨的T-細(xì)胞介導(dǎo)的破壞的患者。給藥根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物將誘導(dǎo)對在攻擊下關(guān)節(jié)軟骨中的自身抗原蛋白質(zhì)和其它自身抗原的全身性免疫耐性，特別是這些患者的特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞的耐性，這些其它自身抗原呈遞通過本發(fā)明的一個或多個肽的氨基酸序列表征或模擬的經(jīng)過鑒定的MHCⅡ型結(jié)合T細(xì)胞表位。因此該誘導(dǎo)耐性將導(dǎo)致攻擊下關(guān)節(jié)軟骨中局部炎癥性反應(yīng)降低。
用于本發(fā)明藥物組合物的非常適宜的肽為含有由總長高達(dá)55個氨基酸的序列側(cè)翼的YKL-39(268-276)或YKL-39(266-278)肽的肽。更優(yōu)選這些肽具有25個氨基酸的長度。甚至更優(yōu)選這些肽的氨基酸序列為FTLASAETT或HSFTLASAETTVG。
當(dāng)與免疫抑制性藥物的非特異性抑制效果比較時，本發(fā)明的肽的優(yōu)點(diǎn)是它們具有對自身反應(yīng)性T細(xì)胞的特異性效果，因此它們使免疫系統(tǒng)的其它組分完整。用本發(fā)明的肽治療安全且無毒副作用產(chǎn)生。
通過給藥高或低劑量的本發(fā)明的肽抗原獲得全身性免疫耐性。肽的量取決于給藥途徑、給藥時間、患者年齡以及總的健康狀況和飲食。
一般來說，可以使用每kg體重0.01-10000μg肽的劑量，優(yōu)選0.05-500μg、更優(yōu)選0.1-100μg肽。
藥用上可接受的載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說為公知，包括例如無菌鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、糊精、瓊脂、果膠、花生油、橄欖油、芝麻油和水。如果希望包埋在脂質(zhì)體中的話，其它載體可以是例如MHCⅡ型分子。
此外本發(fā)明的藥物組合物可以含有一種或多種佐劑。適宜的佐劑包括，尤其是，氫氧化鋁、磷酸鋁、白榴石、生育酚、單膦苯基脂A、胞壁?；暮屠鏠uill A的皂甙。優(yōu)選，用于本發(fā)明的耐性療法的佐劑為與粘膜上皮結(jié)合的例如霍亂毒素B-亞基或carbomers的粘膜佐劑。佐劑的量取決于佐劑自身的性質(zhì)。
而且，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以含有一種或多種穩(wěn)定劑，例如包括山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖糊精和葡萄糖的碳水化合物、例如白蛋白或酪蛋白的蛋白質(zhì)、以及類似堿性磷酸鹽的緩沖液。
適宜的給藥路徑有例如肌肉注射、皮下注射、靜脈注射或腹膜內(nèi)注射、例如噴霧的口服和鼻內(nèi)投藥。
本發(fā)明的另一目的是提供一種測定在關(guān)節(jié)軟骨的破壞中涉及的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的方法和用于所述方法的測定試劑盒。因此，本發(fā)明的肽還非常適宜用于測定在慢性炎癥和關(guān)節(jié)軟骨的破壞中涉及的激活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的存在的診斷方法。
本發(fā)明的診斷方法包括以下步驟a)從個體血樣中分離周圍血液單核細(xì)胞(PBMC)，b)在適宜條件下培養(yǎng)所述PBMC，c)在有本發(fā)明的一種或多種肽的情況下培養(yǎng)所述PBMC培養(yǎng)物，和d)測定T細(xì)胞的反應(yīng)，例如表示在個體中存在被激活的T細(xì)胞的繁殖反應(yīng)。
可以通過例如摻入3H-胸腺嘧啶核苷測定T細(xì)胞的繁殖反應(yīng)的測定。
含有一種或多種本發(fā)明的肽的測定試劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些測定試劑盒適宜用于根據(jù)本發(fā)明的診斷方法中。
以下實(shí)施例是對本發(fā)明的例證說明，無論如何不應(yīng)作為限制本發(fā)明范圍的解釋。


圖1圖1a、b、c為三個不同HC gp-39-特異性雜交瘤(8B12、14G11、20H5)與YKL-39(266-278)的交叉反應(yīng)性(CVR0271B=HC gp-39(263-275),KV0432B=YKL-39(266-278),CC0332B=Chi(269-282),KV0431A=YKL-39(262-274)。HCDA.8B12.1D8,14G11.1H7和20H5.4F6.2F6為對HC gp-39(263-275)特異性的HLA-DRB1*0401-限制性雜交瘤。T-細(xì)胞雜交瘤的活化被表示為IL-2的生產(chǎn)。
圖2為體內(nèi)對HC gp-39(263-275)或YKL-39(266-278)的耐受性通過鼻內(nèi)施加50、10或2微克HC gp-39(263-275)或YKL-39(266-278)之后用HC gp-39(263-275)免疫，使Balb/c小鼠產(chǎn)生耐性。用生理鹽水預(yù)處理或未經(jīng)處理的小鼠作為對照。
實(shí)施例實(shí)施例1 序列對比人軟骨細(xì)胞蛋白，YKL-39與HC gp-39(YKL-40)具有明顯的序列相同性。HC gp-39的另一同源物是通過人巨噬細(xì)胞分泌的并被稱為殼三糖苷酶(Boot等人，1995)。相應(yīng)于RSFTLASSETGVG的序列(HC gp-39(263-275),SEQ ID NO:3)分別在YKL-39蛋白質(zhì)(266-278)中被鑒定為HSFTLASAETTVG，在巨噬細(xì)胞殼三糖苷酶(269-282)中被鑒定為RSFTLASSSDTRVG(SEQ ID NO:4)(表1)。Chi(269-282)含有HLA-DRB1*0401肽結(jié)合基序，該基序以前被用于選擇蛋白質(zhì)中的T-細(xì)胞肽。與此相反，YKL-39(266-278)肽不含該基序。所有肽都是合成的。
表1．HC gp-39(263-275)序列與YKL-39和巨噬細(xì)胞殼三糖苷酶中的相應(yīng)區(qū)域的序列對比

實(shí)施例2 肽與HLA-DRB1*0401的結(jié)合測定來自實(shí)施例1的肽與DAR1*0401-編碼分子結(jié)合。從純合EBV-轉(zhuǎn)化的人B成淋巴細(xì)胞樣細(xì)胞系Huly138IC2中提純HLA-DR4(DRB1*0401)分子，并基本上以Verheijden等人在1997年所述的進(jìn)行該競爭肽HLA-DR結(jié)合試驗(yàn)。給定肽結(jié)合DRB1*0401-編碼分子的親和力與和標(biāo)記肽的競爭有關(guān)。該相關(guān)的結(jié)合親和力以信號降低到50％(IC50)時肽的濃度來定義。該HA-F肽為正對照(Hemagglutinin 307-319；PKFVKQNTLKLAT；在第309位置的Y被F替換；SEQ ID NO:5)。已知該肽對DRB1*0401分子具有高的親和力。
正如所預(yù)料的，發(fā)現(xiàn)Chi(269-282)肽高度親和地結(jié)合到DRB1*0401上(參見表2)。該YKL-39(266-278)肽，沒有提供有效的DRB1*0401肽結(jié)合基序，非常高親和力地結(jié)合到DR4(B1*0401)上。
表2．肽與HLA-DRB1*0401-編碼分子結(jié)合

ND=未測定實(shí)施例3 刺激T-細(xì)胞雜交瘤測定對HC gp-39(263-275)特異性的雜交瘤對其相應(yīng)序列的識別。
為了測定3個不同的HC gp-39-特異性雜交瘤細(xì)胞系與YKL-39或殼三糖苷酶肽的交叉反應(yīng)性，將帶有DRB1*0401特異性的5×104個雜交瘤細(xì)胞和2×105個經(jīng)輻照(12000RAD)、EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞以150μl體積在圓底微量滴定平皿的孔中培養(yǎng)。向一式兩份孔中添加50μl體積的肽抗原(HC gp-39(263-275)、YKL-39(266-278)、殼三糖苷酶(269-282)或?qū)φ针?。使用具有對小鼠IL-2特異的Pharmingen抗體的夾心式ELISA測定48小時后100μl培養(yǎng)物上清液的IL-2生產(chǎn)。
發(fā)現(xiàn)，合成肽YKL-39(266-278)產(chǎn)生與HC gp-39(263-275)相似的反應(yīng)，然而Chi(269-282)不產(chǎn)生反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)暗示，當(dāng)HC gp-39(263-275)或YKL-39(268-278)通過DRB1*0401-編碼分子呈遞時被3個不同雜交瘤利用的3個不同TCR不能在HC gp-39(263-275)或者YKL-39(268-278)之間區(qū)別(圖1a、b、c)，但是能在HC gp-39(263-275)和Chi(269-282)之間區(qū)別(圖1a、b、c)。這些數(shù)據(jù)說明，YKL-39(266-278)為HC gp-39(263-275)的模擬肽。(圖1a、b、c)實(shí)施例4 通過PBMC的YKL-39(266-278)的識別在Ficoll-Paque(Pharmacia,Uppsala,Sweden)上通過標(biāo)準(zhǔn)離心分離將外周血單核細(xì)胞(PBMC)從肝素化外周血液中分離。將這些細(xì)胞以5×105個細(xì)胞/ml的濃度懸浮在24孔平皿的孔中。將這些細(xì)胞在僅有培養(yǎng)基或在有10-50μg/ml肽抗原(YKL-39(266-278))下培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在37℃、5％CO2的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)6天。然后將細(xì)胞懸浮并以4倍將100或150μl體積的培養(yǎng)基分布到96孔圓底平皿的孔中。然后用0.5μCi(1.85×104Bq)[3H]胸腺嘧啶核苷([3H]TdR)將細(xì)胞脈沖，18小時后測定摻入的放射性。表3中所示的結(jié)果解釋了刺激指數(shù)(SI)(抗原特異性計(jì)數(shù)/背景計(jì)數(shù))。
從表3a中可以得出，YKL-39(266-278)表位易于在RA患者中被識別。表3b說明，通過PBMC的YKL-39(266-278)的識別與HC gp-39(263-275)和HC gp-39的識別一致，而且YKL-39(266-278)的識別通常比HC gp-39(263-275)的識別更顯著。
表3a．通過從RA患者的PBMC識別YKL-39(266-278)

SI=抗原特異性計(jì)數(shù)/背景計(jì)數(shù)。SI≥5被認(rèn)為陽性，R=效應(yīng)器，NR=非效應(yīng)器。
表3b．YKL-39(266-278)的識別與HC gp-39(263-275)和HC gp-39蛋白質(zhì)的識別一致

SI=抗原特異性計(jì)數(shù)/背景計(jì)數(shù)。SI≥5被認(rèn)為陽性，R=效應(yīng)器，NR=非效應(yīng)器。NT=未測出。供體447相應(yīng)于破傷風(fēng)類毒素和白色念珠菌。
實(shí)施例5 耐性誘導(dǎo)進(jìn)行適宜用肽抗原監(jiān)控耐性誘導(dǎo)的HC gp-39(263-275)-特異性DTH試驗(yàn)。用在不完全弗氏佐劑(IFA)中的HC gp-39(263-275)的Balb/c小鼠的免疫發(fā)現(xiàn)，在用HC gp-39(263-275)肽攻擊之后，DTH反應(yīng)的誘導(dǎo)是有效的。使用以該肽為基礎(chǔ)的DTH體系檢測通過鼻施加HC gp-39(263-275)肽的DTH反應(yīng)的調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)，以劑量依賴型方式鼻施加HC gp-39(263-275)，負(fù)調(diào)節(jié)了HC gp-39(263-275)-誘導(dǎo)的DTH反應(yīng)。但是，鼻施加YKL-39(266-278)，導(dǎo)致DTH反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)進(jìn)一步加強(qiáng)，這說明YKL-39(266-278)可以有效地耐受用HC gp-39(263-275)誘導(dǎo)的肽特異性反應(yīng)(表4，圖2a、b、c)。
表4．實(shí)驗(yàn)性設(shè)置耐受性實(shí)驗(yàn)

序列表<110>Akzo Nobel N.V.<120>用于自身免疫疾病的免疫療法的新型肽<130><140><141><150>98202470.5<151>1998-07-23<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Phe Thr Leu Ala Ser Ala Glu Thr Thr1 5<210>2<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2His Ser phe Thr Leu Ala Ser Ala Glu Thr Thr Val Gly1 5 10<210>3<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Gly Val Gly1 5 10<210>4<211>14<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly1 5 10<210>5<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Pro Lys Phe Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr1 5 10
權(quán)利要求
1．一種具有9-55個氨基酸殘基的氨基酸序列的肽，含有氨基酸序列FTLASAETT(SEQ ID NO:1)。
2．如權(quán)利要求1的肽，含有氨基酸序列HSFTLASAETTVG(SEQ IDNO:2)。
3．如權(quán)利要求1或2的肽，具有高達(dá)25個氨基酸的氨基酸序列。
4．如權(quán)利要求1或2的肽，具有氨基酸序列FTLASAETT(SEQ IDNO:1)或HSFTLASAETTVG(SEQ ID NO:2)。
5．如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽，用作治療物質(zhì)。
6．含有權(quán)利要求1-4的一種或多種肽和藥用上可接受的載體的藥物組合物。
7．權(quán)利要求1-4的一種或多種肽用于生產(chǎn)誘導(dǎo)對患有自身免疫疾病，更具體地說患有關(guān)節(jié)炎的患者中的自身抗原的特異性T-細(xì)胞耐性的藥物制品的用途。
8．含有權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的一種或多種肽和一測定劑的診斷組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新型肽在肽誘導(dǎo)耐性療法以預(yù)防自身免疫疾病中的用途,并且特別是其在治療關(guān)節(jié)軟骨慢性破壞中的用途。本發(fā)明還涉及含有所述肽的藥物組合物和檢測試樣中自體反應(yīng)性T細(xì)胞的診斷方法。
文檔編號C07K7/08GK1310724SQ99808862
公開日2001年8月29日 申請日期1999年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月23日
發(fā)明者G·F·M·維爾希登, A·M·H·布茨 申請人:阿克佐諾貝爾公司