專利名稱：Wk－5344a物質(zhì)和wk－5344b物質(zhì)及其生產(chǎn)的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)及其生產(chǎn)。更具體而言，本發(fā)明涉及對(duì)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白有抑制作用的新型物質(zhì)WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)及其生產(chǎn)。
2.相關(guān)領(lǐng)域描述由于血管壁中膽固醇積累如成人高血壓所致動(dòng)脈硬化引起的心肌梗死和腦意外，其多種預(yù)防性藥物已知。包括如，普伐他汀、莫維諾林和氟伐他汀(Endo，A.，醫(yī)藥化學(xué)雜志(Journal of MedicinalChemistry)28，401-405，1985和Endo，A.，脂類研究雜志(Journal ofLipid Research)33，1569-1582，1992)。
心肌梗死和腦意外的發(fā)作和這些疾病的過程極其復(fù)雜。因此，十分需要治療這些疾病的具有不同作用機(jī)制的物質(zhì)。
最近，由于日常生活中食品的西方化，因血管壁中膽固醇積累引起的心肌梗死和腦意外的死因增加，并成為生活方式相關(guān)疾病的問題。大多數(shù)膽固醇主要在肝臟和腸中酯化，通過長(zhǎng)鏈脂肪酸形成膽固醇酯，其被分泌到血液中成為乳糜微粒和極低密度脂蛋白的成分，并主要作為低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的成分在血液中循環(huán)。
將肝臟膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到外周組織中的低密度脂蛋白是刺激動(dòng)脈硬化的一個(gè)危險(xiǎn)因素。相反，高密度脂蛋白從外周組織中收集膽固醇，被認(rèn)為是抑制動(dòng)脈硬化進(jìn)展的一個(gè)因素。膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白參與兩種脂蛋白間膽固醇酯的交換反應(yīng)，并參與低密度脂蛋白的成熟。
因此，抑制膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白功能的物質(zhì)可減少血液中動(dòng)脈硬化的危險(xiǎn)因素——低密度脂蛋白，而相反，由于可抑制動(dòng)脈硬化的高密度脂蛋白的增多而產(chǎn)生抗動(dòng)脈硬化作用，并對(duì)這些疾病有效。
發(fā)明概述與目的為了發(fā)現(xiàn)新型生物活性物質(zhì)，我們研究了從土壤中分離的微生物的代謝產(chǎn)物，并發(fā)現(xiàn)從土壤中新分離的微生物菌株WK5344的培養(yǎng)物產(chǎn)生對(duì)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白有抑制作用的物質(zhì)。從該培養(yǎng)物中分離并純化該膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白抑制劑后，由于具有這種化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)尚不清楚，我們將這些物質(zhì)命名為WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)。
本發(fā)明即是根據(jù)這種了解實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供具有下列通式的WK-5344A物質(zhì) 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供具有下列通式的WK-5344B物質(zhì) 本發(fā)明的另一目的在于提供一種生產(chǎn)WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)或其鹽的方法，該方法包括培養(yǎng)一種屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)并具有產(chǎn)生WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的能力的微生物，在培養(yǎng)物中積累WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)，并從該培養(yǎng)物中分離WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)。
優(yōu)選實(shí)施方案描述根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及生產(chǎn)新型物質(zhì)WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)或其鹽的方法，其中具有產(chǎn)生WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的能力、屬于鏈霉菌屬的微生物是鏈霉菌屬的WK-5344種。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種具有產(chǎn)生WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的能力、屬于鏈霉菌屬的微生物，該微生物是鏈霉菌屬的WK-5344(FERM BP-6668)。
具有產(chǎn)生本發(fā)明的WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的能力的微生物(下文稱為產(chǎn)WK-5344物質(zhì)微生物)屬于鏈霉菌屬，并具有無限制地產(chǎn)生WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的能力。用來產(chǎn)生本發(fā)明的WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的優(yōu)選微生物菌株的例子是鏈霉菌WK-5344種，它是由本發(fā)明者從新收集的土壤中分離的。
該菌株的分類學(xué)特征如下。(I)形態(tài)學(xué)特征營(yíng)養(yǎng)菌絲體在多種瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，未見斷裂。氣生菌絲體在無機(jī)鹽-淀粉瓊脂和甘油-天冬酰胺瓊脂上大量生長(zhǎng)，呈白色到灰色。在顯微鏡下觀察，觀察到顯示20個(gè)以上孢子的螺旋和鏈的氣生菌絲體。孢子的形態(tài)是大小為1.0×0.5μm的橢圓形。孢子表面多刺。未見菌核、孢子囊和游動(dòng)孢子。(II)在不同瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性根據(jù)E.B.Shirling和D.Gottlieb(國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志(International Journal of Systematic Bacteriology)16，313，1966)的方法觀察到的生產(chǎn)菌株的培養(yǎng)特性如表1所示。
色調(diào)的確定參照《色彩調(diào)和手冊(cè)》(Color Harmony Manual)第4版(Container Corporation of America，Chicago，1958)作為標(biāo)準(zhǔn)色，并在括號(hào)中表示色調(diào)的名稱。如未特別說明，下表顯示該菌株在不同培養(yǎng)基中27℃培養(yǎng)兩周后培養(yǎng)狀態(tài)的目測(cè)結(jié)果。表1蔗糖-硝酸鹽瓊脂生長(zhǎng) 良好，淡芥褐色(2ie)背面 淡芥褐色-苔綠色(2ie-241g)氣生菌絲體豐富，灰色(5fe)可溶性色素不產(chǎn)生葡萄糖-天冬酰胺瓊脂(ISP)生長(zhǎng) 良好，竹色(2gc)背面 竹色(3ie)氣生菌絲體豐富，雪花石膏色-灰色可溶性色素(13ba-5fe)
淡黃色(1db)甘油-天冬酰胺瓊脂(ISP)生長(zhǎng) 良好，餅干色(2ec)背面 竹色(3ie)氣生菌絲體豐富，雪花石膏色-灰色可溶性色素(13ba-5fe)淡黃色(1db)無機(jī)鹽-淀粉瓊脂(ISP)生長(zhǎng) 良好，竹色(2gc)背面 駝色(3ie)氣生菌絲體 豐富，灰色(5fe)可溶性色素 不產(chǎn)生酪氨酸瓊脂(ISP)生長(zhǎng) 良好，竹色(2gc)背面 淡芥褐色-苔綠色(2ie-241g)氣生菌絲體 豐富，雪花石膏色(5fe)可溶性色素 不產(chǎn)生麥片瓊脂(ISP)生長(zhǎng) 適中，竹色-金黃色(2fb-2kb)背面 竹色-暗褐色(2fb-2li)氣生菌絲體 適中，灰色(5fe)可溶性色素 香櫞色(1gc)酵母膏-麥芽提取物瓊脂(ISP)生長(zhǎng) 良好，竹色(2gc)背面 芥子色(2le)氣生菌絲體 豐富，珍珠灰(13cb)可溶性色素 橄欖黃(11e)營(yíng)養(yǎng)瓊脂生長(zhǎng) 適中，竹色(2gc)
背面 塊金色(2nc)氣生菌絲體 適中，灰色(5fe)可溶性色素 不產(chǎn)生蛋白胨-酵母膏-鐵瓊脂(ISP)生長(zhǎng) 適中，暗金色(2ng)背面 淡芥子褐色(2ie)氣生菌絲體 少，白色(a)可溶性色素 不產(chǎn)生葡萄糖-硝酸鹽瓊脂(ISP)生長(zhǎng) 適中，淡芥子褐色(2ie)背面 芥子色(2le)氣生菌絲體 適中，白色(a)可溶性色素 金色(11/21c)甘油蘋果酸鈣瓊脂生長(zhǎng) 適中，竹色(2gc)背面 淡麥色-竹色(2ea-2gc)氣生菌絲體 豐富，珍珠色(3ba)可溶性色素 香櫞色(1gc)葡萄糖-蛋白胨瓊脂生長(zhǎng) 適中，竹色(2gc)背面 淡麥色-金黃色(2ea-2kb)氣生菌絲體 少，白色(a)可溶性色素 不產(chǎn)生(III)生理特性(1)黑色素(a)酪氨酸瓊脂 陰性(b)蛋白胨-酵母膏-鐵瓊脂陰性(c)葡萄糖-蛋白胨-明膠培養(yǎng)基陰性
(d)胰蛋白胨-酵母提取液陰性(2)酪氨酸酶反應(yīng) 陰性(3)硫化氫產(chǎn)生 陰性(4)硝酸鹽還原 陽(yáng)性(5)明膠液化(21-23℃) 陰性(葡萄糖-蛋白胨-明膠培養(yǎng)基)(6)淀粉水解 陽(yáng)性(7)脫脂乳凝結(jié)(37℃) 陰性(8)脫脂乳胨化(37℃) 陽(yáng)性(9)生長(zhǎng)溫度 9-37℃(10)碳源的利用(Pridham和Gottlieb培養(yǎng)基)利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、蜜二糖、甘露醇、鼠李糖、果糖和肌醇。
略有利用棉子糖和蔗糖(11)纖維素分解陰性(IV)細(xì)胞壁組成細(xì)胞壁的二氨基庚二酸是LL型。
該菌株的分類學(xué)特征總結(jié)如下。
細(xì)胞壁中的二氨基庚二酸是LL型。營(yíng)養(yǎng)菌絲體在多種瓊脂培養(yǎng)基上顯示良好生長(zhǎng)，未見斷裂。氣生菌絲體的形態(tài)為長(zhǎng)孢子鏈螺旋。孢子表面多刺。不同培養(yǎng)特性顯示褐色調(diào)的營(yíng)養(yǎng)菌絲體和白色到灰色調(diào)的氣生菌絲體。在酵母膏-麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基、麥片瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖-天冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基、甘油-天冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖-硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基和甘油-蘋果酸鈣瓊脂培養(yǎng)基上可溶性色素形成是黃綠色素。
根據(jù)這些觀察結(jié)果，該菌株確定為是一種屬于鏈霉菌屬的菌株，稱為鏈霉菌WK-5344種。
該菌株在1999年3月1日保藏于國(guó)際專利保藏單位，國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，位于AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566日本，保藏號(hào)為FERMBP-6668。
盡管產(chǎn)WK-5344物質(zhì)的微生物菌株被作為本發(fā)明的優(yōu)選菌株，但其分類學(xué)特征極易突變?yōu)槲⑸锏钠胀ㄌ卣?，并且不穩(wěn)定。眾所周知，也可通過自然突變技術(shù)突變，或一般進(jìn)行的人工突變技術(shù)如紫外線照射、X線照射或使用誘變劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍和甲磺酸乙酯進(jìn)行突變。因此，本發(fā)明中能使用能產(chǎn)生WK-5344物質(zhì)、屬于鏈霉菌屬的菌株，包括人工突變體和自然突變體。產(chǎn)WK-5344物質(zhì)的菌株中包括通過細(xì)胞工程技術(shù)(如細(xì)胞融合和基因操作)突變的菌株。
在本發(fā)明的WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的生產(chǎn)中，屬于鏈霉菌屬的產(chǎn)WK-5344A物質(zhì)的微生物在優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在該微生物的培養(yǎng)過程中，通常使用用于普通微生物的培養(yǎng)方法。培養(yǎng)基的實(shí)例是含有微生物用可同化碳源、微生物用可消化氮源的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，必要時(shí)可添加無機(jī)鹽。
上述可同化碳源的實(shí)例有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、糊精、纖維素、甘油和有機(jī)酸，它們單獨(dú)或結(jié)合使用。可消化氮源的實(shí)例有有機(jī)氮源如蛋白胨、肉膏、酵母提取物、干酵母、大豆粉、玉米漿、棉籽油、酪蛋白、大豆蛋白水解物、氨基酸和尿素，和無機(jī)氮源如硝酸鹽和氨鹽，它們單獨(dú)或結(jié)合使用。
另外，必要時(shí)可添加無機(jī)鹽如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽和磷酸鹽和重金屬鹽。在培養(yǎng)基中，可添加刺激該菌株生長(zhǎng)及WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)產(chǎn)生的痕量氮元素、生長(zhǎng)刺激物質(zhì)或前體。
培養(yǎng)能在有氧條件下進(jìn)行，如搖瓶培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選地為中性條件。對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)，浸沒通氣是優(yōu)選的。培養(yǎng)條件可以是20-37℃，通常24-30℃，優(yōu)選地27℃。液體培養(yǎng)中培養(yǎng)時(shí)間一般為2-6天，以積累WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)，當(dāng)達(dá)到WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的最大產(chǎn)量時(shí)，可終止培養(yǎng)。
為了根據(jù)所用菌株類型和外部條件獲得優(yōu)選條件，可調(diào)節(jié)并選擇培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、攪拌速度和通氣量。在液體培養(yǎng)中，如果產(chǎn)生泡沫，可使用消泡劑如硅油、植物油和表面活性劑。
由于培養(yǎng)液或培養(yǎng)菌絲體中含有在培養(yǎng)物中積累的WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)，加入助濾劑如硅藻土(Celite)和Hyflosupercell過濾培養(yǎng)物，或離心分離培養(yǎng)液與菌絲體，用有機(jī)溶劑抽提，然后濃縮提取液，并分離WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)。
從培養(yǎng)濾液中分離WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)如下進(jìn)行用不與水混溶的有機(jī)溶劑如乙酸乙酯、乙酸丁酯和苯抽提培養(yǎng)濾液，真空濃縮提取液獲得WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)。這種粗物質(zhì)能用純化親脂性物質(zhì)的已知方法純化，例如使用載體如硅膠或礬土的柱層析，獲得純化的WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)。
為了從菌絲體中分離WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)，用可與水混溶的有機(jī)溶劑如甲醇抽提菌絲體，真空濃縮提取液，用不與水混溶的有機(jī)溶劑如乙酸乙酯、乙酸丁酯或苯抽提濃縮液，并在與以上從培養(yǎng)液中獲得的提取液合并或不合并的情況下純化該提取液，獲得WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)。
本發(fā)明的WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的理化性質(zhì)描述如下。[I]WK-5344A物質(zhì)(1)分子式C45H30N3O13Fe[用高分辨率FAB質(zhì)譜(陽(yáng)性)，測(cè)得m/z877.1203(M＋H)](計(jì)算值877.1206)(2)分子量876[經(jīng)FAB質(zhì)譜(陽(yáng)性)測(cè)定為m/z877(M＋H)+和899(N＋Na)+](3)旋光率[α]D25-3000°(c＝0.01，甲醇)(4)紫外譜在甲醇中測(cè)定的紫外譜如

圖1所示。在280、305(肩)、440和690nm周圍觀察到特異的最高峰。
(5)紅外譜紅外譜(KBr壓片)如圖2所示。λmaxKBrcm-13400、1728、1701、1597、1493、1385、1284、1207和1105。
(6)溶劑中的可溶性在甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿和二甲亞砜中可溶，不溶于水。
(7)物質(zhì)性質(zhì)中性(8)物質(zhì)的顏色與形態(tài)綠色粉末(9)質(zhì)子核磁共振圖3(Varian NMR，在氘甲醇中，400MHz)(10)碳核磁共振圖4(Varian NMR，在氘甲醇中，100MHz)考慮上述理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)確定WK-5344A物質(zhì)的結(jié)構(gòu)如下。 [II]WK-5344B物質(zhì)(1)分子式C46H30N3O14Fe[用高分辨率FAB質(zhì)譜(陽(yáng)性)，測(cè)得m/z905.1151(M＋H)](計(jì)算值905.1155)(2)分子量904[經(jīng)FAB質(zhì)譜(陽(yáng)性)測(cè)定為m/z905(M＋H)+](3)旋光率[α]D25-3000°(c＝0.01，甲醇)(4)紫外譜在甲醇中測(cè)定的紫外譜如圖5所示。在285、303(肩)、445和698nm周圍觀察到特異的最高峰。
(5)紅外譜紅外譜(KBr壓片)如圖6所示。λmaxKBrcm-13400、1718、1701、1597、1508、1385、1281、1196和1105。
(6)溶劑中的可溶性在甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、氯仿和二甲亞砜中可溶，不溶于水。
(7)物質(zhì)性質(zhì)中性(8)物質(zhì)的顏色與形態(tài)綠色粉末(9)質(zhì)子核磁共振圖7(Varian NMR，在氘甲醇中，400MHz)(10)碳核磁共振圖8(Varian NMR，在氘甲醇中，100MHz)考慮上述理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)確定WK-5344B物質(zhì)的結(jié)構(gòu)如下。 如上所述，詳細(xì)敘述了WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的理化性質(zhì)，與這些性質(zhì)相同的化合物未有報(bào)道，因此確定WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)為新物質(zhì)。
本發(fā)明的WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)和抑制活性在下文中說明。(1)對(duì)人膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白的抑制作用按照Kato等人，生物化學(xué)雜志(Journal of Biological Chemistry)264，4082-4087，1989所述的方法，用由人血漿制備的粗蛋白測(cè)定對(duì)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白的作用。
合并重建的含有25μl[1-14C]膽固醇酯的高密度脂蛋白(下文稱為HDL)、10μl人源低密度脂蛋白(下文稱為L(zhǎng)DL)、30μl 7mM 5，5-二硫二硝基苯甲酸，和5μl部分純化的人膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白?？偣?50μl反應(yīng)混合液在37℃下反應(yīng)30分鐘。
反應(yīng)后，加入5μl 0.1％硫酸葡聚糖、5μl 6mM MgCl2和20μl離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)為0.16的磷酸緩沖液，使混合液在冰上20分鐘。在4℃下以13000轉(zhuǎn)/分離心該混合液15分鐘。收集沉淀的LDL級(jí)分。LDL溶解于180μl 0.1N NaOH中，并用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定LDL中轉(zhuǎn)移的膽固醇酯。對(duì)于膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白活性，50％抑制的結(jié)果是0.54μg/mlWK-5344A物質(zhì)，2.0μg/ml WK-5344B物質(zhì)。
如上文所述，本發(fā)明的WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)顯示對(duì)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白有明顯的抑制作用，并認(rèn)為可用于預(yù)防和治療由人體中膽固醇積累引起的疾病。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示本發(fā)明的WK-5344A物質(zhì)的紫外譜(在CH3OH中)。
圖2顯示本發(fā)明的WK-5344A物質(zhì)的紅外譜(KBr壓片)。
圖3顯示本發(fā)明的WK-5344A物質(zhì)的質(zhì)子核磁共振譜(CD3OD)。
圖4顯示本發(fā)明的WK-5344A物質(zhì)的碳核磁共振譜(CD3OD)。
圖5顯示本發(fā)明的WK-5344B物質(zhì)的紫外譜(在CH3OH中)。
圖6顯示本發(fā)明的WK-5344B物質(zhì)的紅外譜(KBr壓片)。
圖7顯示本發(fā)明的WK-5344B物質(zhì)的質(zhì)子核磁共振譜(CD3OD)。
圖8顯示本發(fā)明的WK-5344B物質(zhì)的碳核磁共振譜(CD3OD)。
發(fā)明實(shí)施方案詳述下列實(shí)施例說明了本發(fā)明，但不應(yīng)看作是限制本發(fā)明。
含有4.0％可溶性淀粉、2.0％溶劑抽提的烤大豆粉、32μl/l 0.1N硫代硫酸鈉、0.05％FeSO4·7H2O、0.05％KH2PO4和0.03％KCl的培養(yǎng)基(調(diào)節(jié)為pH6.5)在30升小型發(fā)酵罐中蒸汽滅菌。冷卻后無菌接種200ml種子培養(yǎng)液，并在250轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢琛?0升/分通氣下27℃培養(yǎng)96小時(shí)。
培養(yǎng)后，離心培養(yǎng)液獲得的菌絲體用6升丙酮抽提。真空濃縮提取液除去丙酮，調(diào)節(jié)為pH5.0，用10升乙酸乙脂抽提，并真空濃縮提取液，獲得粗物質(zhì)9.20克。粗物質(zhì)在己烷、甲醇和水(40∶19∶1)中分配，收集分配于下層的WK-5344物質(zhì)，真空濃縮獲得粗物質(zhì)1.29克。將粗物質(zhì)懸浮于10ml乙腈中，裝填于ODS柱(20ml，Senshu Co.，SSC-ODS-7515-12)上，用含0.05％磷酸的乙腈洗脫層析。
合并洗脫的12ml級(jí)分，并合并含有活性成分的級(jí)分。除去乙腈后，用乙酸乙酯抽提水層級(jí)分，并真空干燥，獲得粗活性物質(zhì)157mg。
將157mg粗活性物質(zhì)溶解于1.57ml甲醇中，裝填于ODS柱(147ml，Senshu Co.，SSC-ODS-7515-12)上，用含0.05％磷酸的乙腈逐步洗脫層析。合并洗脫的12ml級(jí)分，并合并含有活性成分的級(jí)分。除去乙腈后，用乙酸乙酯抽提水層級(jí)分，并真空干燥，獲得粗活性物質(zhì)19.5mg。
將19.5mg粗活性物質(zhì)溶解于0.5ml氯仿中，裝填于硅膠柱(126ml，Kiesel gel60)上，用氯仿和甲醇洗脫層析。每一級(jí)分分離為12ml。結(jié)果，分離到1.69mg WK-5344A物質(zhì)和1.12mg WK-5344B物質(zhì)。
發(fā)明作用如上所述，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種屬于鏈霉菌屬并具有產(chǎn)生WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的能力的微生物，以在培養(yǎng)物中積累WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)。從該培養(yǎng)物中收集WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)，獲得對(duì)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白有抑制作用的物質(zhì)。預(yù)計(jì)該物質(zhì)對(duì)成人疾病如動(dòng)脈硬化引起的心肌梗死和腦意外有預(yù)防和治療作用。
權(quán)利要求
1.以下列通式表示的WK-5344A物質(zhì)或其鹽
2.以下列通式表示的WK-5344R物質(zhì)或其鹽
3.一種生產(chǎn)WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)或其藥學(xué)可接受的鹽的方法，包括培養(yǎng)屬于鏈霉菌屬并具有在培養(yǎng)基中產(chǎn)生WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的能力的微生物，在培養(yǎng)基中積累WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)，從培養(yǎng)基中分離WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)，若需要時(shí)將該物質(zhì)轉(zhuǎn)化為其藥學(xué)可接受的鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中屬于鏈霉菌屬并具有產(chǎn)生WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的能力的微生物是鏈霉菌屬的WK-5344。
5.一種屬于鏈霉菌屬并具有產(chǎn)生WK-5344A物質(zhì)和WK-5344B物質(zhì)的能力的微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的微生物，其中該微生物是鏈霉菌WK-5344FERM BP-6668。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白有抑制作用的新型物質(zhì)WK－5344A物質(zhì)和WK－5344B物質(zhì),及其生產(chǎn)方法。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種屬于鏈霉菌屬并具有產(chǎn)生WK－5344A物質(zhì)和WK－5344B物質(zhì)的能力的微生物,在培養(yǎng)基中積累WK－5344A物質(zhì)和WK－5344B物質(zhì),然后從該培養(yǎng)基中分離WK－5344A物質(zhì)和WK－5344B物質(zhì)。由于該物質(zhì)顯示對(duì)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白有明顯的抑制作用,所以該物質(zhì)可有效地用于預(yù)防和治療由人體中膽固醇積累引起的疾病。
文檔編號(hào)C07F15/00GK1333836SQ99815565
公開日2002年1月30日 申請(qǐng)日期1999年3月8日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月8日
發(fā)明者大村智, 供田洋, 高橋洋子 申請(qǐng)人:社團(tuán)法人北里研究所