專利名稱：殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用殼聚糖與金屬形成配合物后氧化降解制備窄分子量分布寡聚糖的新方法。更具體地說(shuō)是將殼聚糖與金屬進(jìn)行配位-氧化裂解，經(jīng)必要后處理，得到數(shù)均分子量及分子量分布范圍符合特有生物生理活性、醫(yī)療保健功能要求，有著廣泛用途的低聚寡糖。
目前，殼聚糖降解制備低聚水溶性殼聚糖的方法主要有酶降解法、氧化降解法、酸降解法，其次還有微波法、超聲波法、輻射法等?，F(xiàn)有的酶降解法主要依賴于殼聚糖酶、脂肪酶、溶菌酶以及其他非專一性水解酶，能得到較高收率的六至八糖，這種糖在食品及醫(yī)藥方面(抗癌藥物)用途廣泛，但在選擇合適的酶種以適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)上尚存在困難，即缺乏以經(jīng)濟(jì)成本進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的可能；而現(xiàn)已用于殼聚糖產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)(如“鱘之寶”膠囊一上海偉康生物制品公司生產(chǎn))的氧化降解法，包括了H2O2氧化法、H2O2-NaClO2法、H2O2-HCl法、和其他一些氧化降解法。但是這種方法對(duì)殼聚糖降解存在的最大問題是在降解過(guò)程中引入了各種反應(yīng)試劑，使得對(duì)其降解副反應(yīng)的控制以及在降解產(chǎn)物的分離純化方面增加了難度；酸降解法，它包括HCl降解法、酸-亞硝酸鹽法、過(guò)醋酸法、其他酸解法。其中用HCl降解法得到的低聚水溶性殼聚糖-鹽酸鹽的分子量分布比較寬。用酸-亞硝酸鹽法可制備相對(duì)較高含量的12至19(分子量在2000-3000，分布相對(duì)狹窄)低聚水溶性殼聚糖。酸解法和單純的氧化降解法都是非特異性的降解過(guò)程，其降解過(guò)程較難控制，雖然已先后用于工業(yè)化生產(chǎn)，并且各種分子量范圍的殼聚糖產(chǎn)品都能得到，但要想得到特定分子量范圍且具有較高收率，和能廣泛應(yīng)用的殼聚糖產(chǎn)品仍是比較困難的；而其他降解法如微波法、超聲波法、輻射法等，也可以得到低聚水溶性殼聚糖，但仍然屬于非特異性降解過(guò)程，目前尚屬基礎(chǔ)研究探索階段?？梢哉f(shuō)除酶降解法外，凡屬非特異性降解過(guò)程降解得到的產(chǎn)物都有其無(wú)法解決的平均分子量分布寬這一難題。
本發(fā)明的目的是避開目前工業(yè)生產(chǎn)中采用的以非特異性降解過(guò)程為機(jī)制的，制備低聚水溶性殼聚糖過(guò)程所表現(xiàn)出的種種弊端和不足，提供一種殼聚糖與金屬形成配合物后氧化控制降解的新方法，人為制造特異性降解的氛圍，使制備獲取寡糖之目的終得以實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的原理是以殼聚糖(Chitosan,(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-匍萄糖為主的聚合體)為原料，將這種含有氨基的殼聚糖在與金屬離子形成配合物的同時(shí)，破壞分子間及分子內(nèi)氫鍵，降低溶液粘度，以使其能夠達(dá)到經(jīng)氧化降解后，制備出較為專一分子量的寡糖配合物，然后用螯合劑將“廢”金屬除去，便可獲得專一分子量(低于1萬(wàn))，具有獨(dú)特的生理、生物活性和醫(yī)療特性的低聚水溶性殼聚糖(寡糖)。要想達(dá)到這一目的，必須在制備過(guò)程中準(zhǔn)確把握每個(gè)制備環(huán)節(jié)中的每一細(xì)節(jié)。首先通過(guò)測(cè)量脫乙酰度計(jì)算出自由氨基的個(gè)數(shù)(摩爾數(shù))。其次是根據(jù)不同金屬的配位性質(zhì)，將定量的金屬離子加入殼聚糖溶液中，這樣可使大分子殼聚糖中的部分氨基以配合物形式存在，在進(jìn)行這一過(guò)程的同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了降低溶液粘度，即鹽效應(yīng)結(jié)果。這一過(guò)程便可使金屬離子靠自由擴(kuò)散作用在高分子間及分子內(nèi)隨機(jī)均勻地形成定量的配位結(jié)點(diǎn)，使得大分子隨機(jī)結(jié)合后，自然分成了如附圖2中所示的有配位金屬存在的配位結(jié)點(diǎn)和未參與配位的自由殼聚糖糖苷鏈?？尚蜗蟮膶⒔饘俅嬖诘呐湮唤Y(jié)點(diǎn)看作是附圖表2中網(wǎng)上的網(wǎng)結(jié)，將未參與配位的自由殼聚糖糖苷看作是附圖2中網(wǎng)上的網(wǎng)線。對(duì)于有些金屬來(lái)說(shuō)，氧化后殼聚糖鏈?zhǔn)菑慕饘汆徑课粩噫I的，而對(duì)于另一些金屬來(lái)說(shuō)，也可以是從配位構(gòu)型造成的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象部位斷鍵。同時(shí)證明金屬加入量越多，配位結(jié)點(diǎn)越多，網(wǎng)越密，網(wǎng)節(jié)越短。即殼聚糖糖苷鏈越短，降解后的糖數(shù)越少，反之，糖數(shù)則多。本發(fā)明采用的溶液介質(zhì)體系包括HAc-H2O、NaAc-HAc-H2O，以及其他一些除H2O2氧化法以外的溶解體質(zhì)體系；以及本發(fā)明提到的醋酸銅、醋酸鎳、醋酸鑭、醋酸鐵、氯化鋇金屬鹽，及正在大范圍涉及到的主族金屬、稀土金屬、過(guò)度金屬鹽的特性。本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)中采取多重對(duì)照方式1)測(cè)定脫乙酰度，計(jì)算出原料氨基的個(gè)數(shù)，根據(jù)所需降解窄分子量要求，選擇不同性質(zhì)、原子半徑的金屬并計(jì)算出所需加入金屬離子的摩爾數(shù)2)用適宜濃度、適量體積的酸性水溶液在適宜溫度、pH值及攪拌條件下溶解殼聚糖固體，并使其溶解完全3)將配制為一定濃度的金屬鹽水溶液加入溶解完全的殼聚糖溶液中，調(diào)節(jié)pH值、攪拌、控溫使金屬離子與殼聚糖配位反應(yīng)完全；4)在適宜pH值、適宜溫度、攪拌條件下滴入適量摩爾濃度的氧化劑，并維持一定時(shí)間使氧化降解反應(yīng)完全；5)在一定溫度下用堿調(diào)節(jié)pH值，對(duì)可在pH5～8時(shí)形成氫氧化物沉淀的金屬先考慮用此法過(guò)濾去除金屬，無(wú)沉淀生成的考慮加入適宜金屬的螯合劑用絡(luò)合沉淀法過(guò)濾去除，對(duì)不易生成沉淀的金屬可考慮螯合萃取去除；6)除去金屬的母液經(jīng)適當(dāng)濃縮后即可得所需產(chǎn)品的一定濃度的水溶液，產(chǎn)品的數(shù)均分子量及分子量分布范圍參數(shù)可通過(guò)粘度計(jì)和糖分析專用高效液相色譜測(cè)得；7)對(duì)于要求相差2～4糖范圍的低聚殼聚糖可通過(guò)GPC(gelpermeation chromatography膠凝滲透色層[分離]法)專用設(shè)備作層析柱分離來(lái)獲取。
以上過(guò)程明確了通過(guò)控制對(duì)金屬的加入量，使糖個(gè)數(shù)與金屬離子形成定比例關(guān)系，限定降解后糖數(shù)的多少，這便約束了降解后的分子量的專一性，使降解通過(guò)氧化劑氧化來(lái)最終實(shí)現(xiàn)。經(jīng)本發(fā)明所采取的多重實(shí)驗(yàn)的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果可總結(jié)如下ⅰ)同濃度、同pH值、同溫度下，加金屬離子的殼聚糖溶液較不加金屬離子的殼聚糖溶液的粘度低，并與加入量有關(guān)；ⅱ)含金屬離子的溶液在加入等量H2O2后，其降解速率比不加金屬離子的要快得多；ⅲ)不同金屬離子引起的降解速率也不同。如銅離子大于鎳離子；ⅳ)改變金屬及H2O2加入量可有效地控制降解后溶液的粘度，既控制平均分子量范圍；ⅴ)完全氧化可使殼聚糖完全降解。實(shí)驗(yàn)中已表現(xiàn)出銅離子存在催化性；ⅵ)實(shí)驗(yàn)經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用分析發(fā)現(xiàn)了含氨基小分子和多羥基小分子的分子離子峰，這說(shuō)明降解應(yīng)從配位區(qū)開始。這恰恰說(shuō)明斷鍵后片斷分子量分布受配位鍵限制變得較為專一的結(jié)果。
以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作一說(shuō)明。
附

圖1是本發(fā)明殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解方法工藝流程圖。
附圖2是本發(fā)明理想的殼聚糖糖苷鏈金屬配位后形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)示意圖。圖中M為配位結(jié)點(diǎn)，彈簧式線段為未配位糖苷段。
由附圖1和附圖2可知本發(fā)明殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解是先測(cè)定所采用原料殼聚糖的脫乙酰度，并計(jì)算出其中氨基的摩爾數(shù)，以0.1～10％的醋酸水溶液攪拌溶解，再兌稀使其形成0.001～0.5溶液。然后根據(jù)不同金屬的配位能力強(qiáng)弱、金屬離子半徑大小，確定金屬離子的加入量，稱量后用蒸餾水配成0.001-0.5的溶液在攪拌下滴入殼聚糖稀溶液中，使金屬離子自由擴(kuò)散到大分子殼聚糖的氨基部位并形成配位鍵。由于高聚殼聚糖中部分氨基與金屬離子形成配合物，由此將大分子變?yōu)榫W(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。從附圖2得知，通過(guò)控制金屬加入量，可使糖個(gè)數(shù)與金屬離子形成定比例關(guān)系，限定未配位殼聚糖苷鏈大小，來(lái)約束降解后分子量的專一性，這一表現(xiàn)已被確認(rèn)為“金屬配位-氧化裂解”原理對(duì)殼聚糖控制降解過(guò)程中的核心所在。在這種情況下應(yīng)加入過(guò)氧化氫在一定時(shí)間內(nèi)控溫氧化降解，降解后的混合物通過(guò)三種附加方法除去金屬離子1)、可采用螫合沉淀法去除金屬離子；2)、離子交換樹脂去除金屬離子；3)、使用特性柱去除金屬離子。去除金屬離子后，將寡聚殼糖母液進(jìn)行中和、純化，即得到最終產(chǎn)物的寡聚殼聚糖水溶液。按附圖1中的步驟制備或購(gòu)買合乎降解指標(biāo)要求的殼聚糖作為基本原料。在其與金屬離子配位前，取少量測(cè)定其脫乙酰度，根據(jù)脫乙酰度計(jì)算金屬離子加入量(摩爾數(shù))。加進(jìn)0.1％-10％的醋酸水溶液，在溫度10～60℃之間，攪拌4～36小時(shí)使其溶解完全。再將如主族金屬離子、過(guò)渡金屬離子或稀土金屬離子配成稀的水溶液，在攪拌條件下緩慢加入體系中。然后在溫度0～80℃范圍內(nèi)，反應(yīng)2～12小時(shí)后，調(diào)節(jié)pH值在2～6之間，使之配位反應(yīng)完全。再加入摩爾數(shù)與金屬離子摩爾數(shù)相同或略大于金屬離子摩爾數(shù)，濃度為0.01～25％的過(guò)氧化氫(H2O2)，在溫度0～60℃之間，0.3～24小時(shí)之間氧化降解。再用0.1～10％稀堿(NaOH、Na2CO3等)調(diào)節(jié)pH值，使其中可生成氫氧化物沉淀的金屬先完全沉淀，過(guò)濾除去對(duì)于不生成氫氧化物沉淀的金屬用絡(luò)合劑沉淀后過(guò)濾除去；對(duì)于金屬鈉離子等用交換樹脂去除金屬。將去除金屬的母液經(jīng)真空濃縮后既得到產(chǎn)品。最后將所得產(chǎn)品送去作層析分離，收集不同分子量段的組份，給出產(chǎn)物參數(shù)和指標(biāo)。
為了更進(jìn)一步的說(shuō)明本發(fā)明殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解原理，現(xiàn)以實(shí)施例加以詳述。
實(shí)施例1取殼聚糖0.5克，以1∶2～5的比例溶于HAC和水的混合溶液中，使其完全溶解后，采用酸堿滴定法測(cè)定其游離氨基保持在原加入量的78～86％。然后稱取0.005～0.05醋酸銅Cu(OAc)2·2H2O，加入殼聚糖溶液中，送進(jìn)攪拌器在10～60℃的溫度下，攪拌20～140分鐘，再加入0.6～25％的氧化劑(H2O2)水溶液，在0～60℃的溫度下繼續(xù)攪拌約1～360小時(shí)后得到降解絡(luò)合物。然后將降解絡(luò)合物pH值調(diào)至5-6之間(弱酸性)，再加進(jìn)DMBTA(自合成銅Cu絡(luò)合劑)生成Cu-DMBTA沉淀，過(guò)濾去除廢金屬。將得到的寡聚殼聚糖母液加入4～8％碳酸鈉再次調(diào)節(jié)母液pH值至6～8，真空濃縮，得寡聚殼聚糖母液主要為2～6的寡糖。
實(shí)施例2將準(zhǔn)備好的殼聚糖原料取出0.5克，加入1∶2～10的HAC和水混合溶液中，殼聚糖原料溶解后，采用酸堿滴定法測(cè)定以上殼聚糖混合溶液中的游離氨其數(shù)保持在78～86％，再取0.001～0.01M的銅Cu(Ac)2·2H2O加入到以上溶液中，送進(jìn)攪拌器后，在溫度5～55℃下攪拌，反應(yīng)20分鐘～20小時(shí)后，再加氧化劑，再次在0～55℃的溫度下進(jìn)行攪拌和降解絡(luò)合物約20分鐘～24小時(shí)，然后對(duì)得到的降解絡(luò)合物進(jìn)行調(diào)節(jié)其pH值至5～6(酸性)時(shí)，再采用一種自合成的銅(Cu)絡(luò)合劑DMBTA去除廢金屬離子后得到寡聚殼聚糖母液，將母液送去過(guò)濾，并再次調(diào)節(jié)濾液pH值至7～8(中性)時(shí)，濃縮，最終得到主要成份為6～12的寡糖。
本發(fā)明殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解有以下優(yōu)特點(diǎn)1、在原理上避開了目前工業(yè)生產(chǎn)中采用的以非特異性降解過(guò)程為機(jī)制的種種弊端和不足，人為的制造了特異性降解的氛圍。
2、可通過(guò)選擇不同半徑、不同用量的金屬離子與高聚殼聚糖形成配合物。再通過(guò)氧化斷鍵降解方便的得到所需降解范圍窄分子量分布的低聚殼聚糖。方法簡(jiǎn)便，易操作，所選用試劑廉價(jià)易得，所得產(chǎn)品在實(shí)際應(yīng)用中穩(wěn)定、可靠。
3、可滿足工業(yè)化批量生產(chǎn)。
權(quán)利要求
一種殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解，其特征是以殼聚糖為基本母體，降低其基本母體的粘度，使其可與金屬鹽配合形成配合物，在一定溫度、一定PH值下保持穩(wěn)定均一的存在狀態(tài)，而達(dá)到氧化降解的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解，其特征在于其中殼聚糖是從水產(chǎn)養(yǎng)殖、海洋生物中的蝦、蟹殼及昆蟲、藻類和細(xì)菌生成的主要提取物之一。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于其中金屬鹽包括主族金屬元素、過(guò)渡金屬元素以及稀土金屬元素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于其中殼聚糖中須加進(jìn)0.1～10％的有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸水溶液，在0～100℃的溫度下，經(jīng)過(guò)20分鐘～48小時(shí)進(jìn)行溶解，降低其粘度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于其中主族金屬元素在加入殼聚糖有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸水溶液中時(shí)，其濃度一般保持在0.01～10％，其pH值在1～6稀土金屬元素在加入殼聚糖有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸水溶液中時(shí)，其濃度一般保持在0.01～10％，其pH值為1～6過(guò)渡金屬元素在加入殼聚糖有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸水溶液中時(shí)，其濃度一般保持在0).01～10％，其pH值為1-6。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于其中殼聚糖與金屬配合形成的殼聚糖金屬配合物，采用0.01～25％的氧化劑，在0～55℃溫度下，經(jīng)20分鐘～76小時(shí)降解。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、6所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于除過(guò)氧化氫H2O2、H2O2-NACIO2、H2O2-HCI以外的其他氧化劑，以及對(duì)殼聚糖金屬配合物形成與控制降解有同等作用的物質(zhì)體系。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、3、5、6所述的殼聚糖金屬配合物形成與控制降解，其特征在于其中主族、過(guò)渡、稀土金屬離子在其與殼聚糖配位降解后，脫去其中配位離子時(shí)，需加入比以上各類金屬多1.0～14％摩爾量的無(wú)毒性強(qiáng)金屬螯合劑、金屬沉淀劑(以水處理金屬沉淀劑為主)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7、8所述的殼聚糖金屬配合物的形成與控制降解，其特征在于其中寡聚殼聚糖母液在去除以上各類金屬離子時(shí)ⅰ)可采納自合成的金屬離子絡(luò)合劑DMBTA等系列產(chǎn)品，以螫合沉淀法去除金屬離子ⅱ)離子交換樹脂去除，ⅲ)以特性柱去除均可達(dá)到使寡聚殼聚糖母液分離、純化的目的。
10.對(duì)于要求相差2-4糖范圍的低聚殼聚糖可在粗產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，通過(guò)GPC專用層析柱生產(chǎn)。
10.對(duì)于要求相差2-4糖范圍的低聚殼聚糖可在粗產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，通過(guò)GPC專用層析柱生產(chǎn)。
全文摘要
一種采用“金屬配位－氧化裂解”原理對(duì)殼聚糖控制降解，制備窄分子量分布寡聚殼聚糖的新方法。其原理是利用生物甲殼素脫乙?；髿ぞ厶侵胁糠职被跋噜徚u基與加入的適宜金屬在稀溶液中配位。通過(guò)控制糖與金屬離子摩爾數(shù)的比例控制配位點(diǎn)的個(gè)數(shù)。稀溶液中配位使配位結(jié)點(diǎn)在殼聚糖高分子鏈中均勻分布，即保證了配位結(jié)點(diǎn)之間未配位糖苷鏈中糖數(shù)的均一性。氧化從配位結(jié)點(diǎn)或優(yōu)勢(shì)構(gòu)象處裂解高分子鏈，后處理得到窄分子量分布的低聚寡聚糖。
文檔編號(hào)C08B37/08GK1317496SQ00105049
公開日2001年10月17日 申請(qǐng)日期2000年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月11日
發(fā)明者張岐, 林強(qiáng), 尹學(xué)瓊, 于文霞, 馮玉紅 申請(qǐng)人:海南大學(xué)