三功能肽修飾的基因載體及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種三功能肽修飾的基因載體及其制備方法與應用。具體地，提供了具有靶向腫瘤、促進穿膜和核定位三重功能的多肽，該多肽與兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺偶聯(lián)形成的基因載體及其制備方法，該基因載體與DNA形成的復合物，以及上述具備三重功能的多肽和基因載體在制備用于基因治療的藥物中的應用。本發(fā)明的基因載體體內轉染效率高、細胞毒性低、靶向性強，具有廣闊的臨床應用前景。
【專利說明】三功能肽修飾的基因載體及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程和分子生物學【技術領域】，具體地說，涉及一種三功能肽修飾的基因載體及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]基因治療是近年來建立在基因工程技術和分子遺傳學原理基礎上的新型治療方法，因腫瘤發(fā)生與發(fā)展的生物學基礎是基因突變，所以基因治療現(xiàn)已成為攻克腫瘤最具希望，也是研究最活躍的領域。 [0003]基因治療有三個重要環(huán)節(jié)，即目的基因、轉基因載體和靶細胞?；驅胂到y(tǒng)是基因治療的核心技術。現(xiàn)階段面臨的最大難題在于尚未找到理想的基因載體。目前應用的載體包括病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體轉染效率較高但存在運載能力低、有潛在安全威脅等問題，因此，非病毒載體近年來發(fā)展迅速，尤其是陽離子聚合物。
[0004]聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)是近年來研究最為廣泛的陽離子多聚物非病毒基因載體，富含陽離子，具有強大的緩沖能力，有較強結合DNA和黏附細胞的能力。然而，PEI作為基因載體使用存在兩個突出問題。第一，轉染效率與細胞毒性存在矛盾:小分子PEI雖細胞毒性低，但在生理的離子濃度下與DNA易發(fā)生解離，造成轉染效果差；分子量在20kDa以上的PEI雖具有較理想轉染效率，但由于PEI的表面富含陽性電荷以及體內不可降解性，致使高分子量PEI表現(xiàn)出較強的細胞毒性。第二，PEI靶向性差:它是利用自身所帶的正電荷，與細胞表面帶負電荷的受體通過靜電作用相結合，所以細胞的選擇特異性差，解決靶向性問題已成為非病毒載體中最為關注的問題。因此，如何將PEI改造成轉染效率高、細胞毒性低、靶向性強的基因載體材料是解決PEI應用難題的突破口。
[0005]為解決PEI作為基因載體使用中存在的問題，2010年本課題組申請并獲得了項目名稱為“殼聚糖季銨鹽連接低分子量聚乙烯亞胺作為骨架的靶向DNA納米復合物的構建及其抗腫瘤作用研究”的國家自然科學基金資助，并就研究成果申請了專利，參見申請?zhí)朇N201110372497.6，
【公開日】2012.06.27。兩親性殼聚糖N-辛基-N-季銨化殼聚糖(OTMCS)無毒、無刺激、無免疫原性，通過化學交聯(lián)的方法連接PEI，尤其低分子量PEI (如PEI 600/800/2000),以形成多分枝狀或網狀結構的高分子量PEI衍生物，該衍生物可保證較高轉染效率，轉染進入體內細胞后，這些交聯(lián)的化學鍵又可以通過水解等反應斷開，高分子量PEI衍生物斷裂成易代謝的低分子量低毒性的PEI，這就使得其在保證一定轉染效率的前提下，大大降低了高分子PEI所帶來的細胞毒性；另一方面，OTMCS同時具有親水鏈和疏水鏈，在水中可自發(fā)形成多分子球形膠束樣結構，該膠束可顯著提高復合物在體液中的穩(wěn)定性，且尺寸可達納米級，因此適宜基因藥物在體內的傳輸。
[0006]發(fā)明人還提交過專利申請CN201110372844.5，
【公開日】2012.04.04，該研究是將普朗尼克P123連接PEI，得到多分枝狀或網狀結構的高分子量PEI衍生物P123-PEI，選擇特異親和整合素a 3的RGD短肽，與細胞穿膜肽Tat (49-57)連接，合成具有靶向于av^3 3和促進載體穿膜的雙功能肽，再利用交聯(lián)技術將R13與PEI衍生物偶聯(lián)，構建新型非病毒基因載體系統(tǒng)，并檢驗了該系統(tǒng)的細胞毒性和體外轉染效率。
[0007]然而，上述兩種非病毒基因載體系統(tǒng)雖然表現(xiàn)出體液穩(wěn)定性增強、細胞毒性明顯降低、體外轉染效率及腫瘤靶向能力提高等一系列優(yōu)點，但其體內轉染效率較體外明顯偏低，這也是目前非病毒基因載體研究中普遍存在的共性問題。究其原因，可能涉及以下兩個方面:其一是體內環(huán)境復雜，復合物入體內后要面臨免疫系統(tǒng)及生理屏障等諸多因素干擾；其二是體內外轉染跨越細胞核膜的方式不同，其中后者更為關鍵。復合物細胞內解離機理的研究表明，細胞中RNA導致其目的基因的釋放，因RNA在細胞中主要分布在細胞核，所以聚合物/DNA復合物也是需要進入到細胞核中，并被RNA解離從而發(fā)揮作用的。因此，如何提高陽離子復合物在體內靶細胞的核遞送成為其能否應用于臨床的關鍵之一。
[0008]核定位信號肽NLS是核內功能蛋白進入細胞核的結構基礎，是介導某些蛋白入核的一段充分而必要的信息片段，大分子物質可通過NLS的介導經核孔復合物主動運轉至細胞核內，其中研究最多的NLS是來自SV40的T抗原,主要功能序列為Lys-Lys-Lys-Arg-Lys(KKKRK)0
[0009]因此，理論上可將R⑶短肽、細胞穿膜肽Tat (49-57)、NLS (KKKRK)連接，合成具有靶向于a V P 3、促進載體穿膜、入核的含RGD和Tat (49-57) ,NLS (KKKRK)的三功能多肽，用于修飾0TMCS-PEI衍生物，提高其腫瘤細胞選擇性，又可促進載體穿膜，并提高核遞送能力，從而增加DNA的體內轉染效率。

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種多肽。
[0011]本發(fā)明的再一的目的是，提供一種基因載體。
[0012]本發(fā)明的另一的目的是，提供上述基因載體的制備方法。
[0013]本發(fā)明的第四個目的是，提供一種復合物。
[0014]本發(fā)明的第五個目的是，提供上述多肽及基因載體的用途。
[0015]為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:
一種多肽，所述的多肽的氨基酸序列為:Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys0
[0016]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:
一種基因載體，所述的基因載體包含兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺與如上所述的多肽所形成的偶聯(lián)物，所述的兩親性殼聚糖的分子量為l_20KDa，所述的聚乙烯亞胺的分子量為0.6-70KDa，所述的兩親性殼聚糖與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:1-1:20。
[0017]優(yōu)選地，所述的兩親性殼聚糖與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:1-1:10。更優(yōu)選地，所述的兩親性殼聚糖與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:10。
[0018]優(yōu)選地，所述的兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺與多肽的摩爾比為1:1-1:15。更優(yōu)選地，所述的兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺與多肽的摩爾比為1:2-1:10。
[0019]為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:
如上任一所述的基因載體的制備方法，包括以下步驟:
(a)合成如上所述的多肽；
(b)于兩親性殼聚糖中加入三光氣，溶于無水甲苯和無水二氯甲烷的溶劑中反應過夜，除去溶劑后再用適量溶劑溶解，加入N-羥基琥珀酰亞胺活化，將活化后的兩親性殼聚糖用二氯甲烷溶解，與無水乙醇溶解的聚乙烯亞胺混合，攪拌，偶聯(lián)得到兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺；
(C)馬來酰亞胺化步驟(b)制備的兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺，再加入步驟(a)合成的多肽，攪拌，偶聯(lián)。
[0020]為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:
如上任一所述的基因載體與DNA形成的復合物。
[0021]所述的DNA可以含報告基因、抗癌基因和/或細胞因子基因。
[0022]為實現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:
如上所述的多肽以及如上任一所述的基因載體在制備用于基因治療的藥物中的應用。
[0023]本發(fā)明優(yōu)點在于:
將具有靶向腫瘤細胞功能的RGD肽、促進穿膜的Tat (49-57)短肽與核定位信號肽NLS連接，合成了具有三重功能的多肽，此新型多肽在國內外研究中尚未見報道，然后將其與兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺偶聯(lián)，并對各物質間的最佳摩爾比進行優(yōu)化，構建了新型的非病毒基因載體系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)體內轉染效率高、細胞毒性低、靶向性強，是一種優(yōu)良的基因載體材料，具有廣闊的臨床應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是實施例1的OTMCS核磁共振氫譜圖。
[0025]圖2是實施例1的0TMCS-PE1-R18細胞毒性實驗結果。圖中，左起第一簇的 7 根柱子從左至右分別代表 0TMCS-PE1-R18h、0TMCS-PE1-R181、OTMCS-PE1-R13h、OTMCS-PE1-R131, OTMCS-PEI, PEI (2KDa)、PEI (25KDa)。后續(xù)每簇的 7 根柱子所分別代表的含義同上。
[0026]圖3是實施例1的0TMCS-PE1-R18體外轉染效率實驗結果。
[0027]圖4是實施例1的0TMCS-PE1-R18體內轉染效率實驗結果。
【具體實施方式】
[0028]下面結合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0029]本文中，SMCC是一類含有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯和馬來酰亞胺的雙功能偶聯(lián)劑，可以將分別含有巰基和氨基的化合物鍵接在一起，分子結構為
【權利要求】
1.一種多肽,其特征在于,所述的多肽的氨基酸序列為=Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Lyso
2.一種基因載體，其特征在于，所述的基因載體包含兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺與權利要求1所述的多肽所形成的偶聯(lián)物，所述的兩親性殼聚糖的分子量為l_20KDa，所述的聚乙烯亞胺的分子量為0.6-70KDa，所述的兩親性殼聚糖與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:1-1:20。
3.根據(jù)權利要求2所述的基因載體，其特征在于，所述的兩親性殼聚糖與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:1-1:10。
4.根據(jù)權利要求3所述的基因載體，其特征在于，所述的兩親性殼聚糖與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:10。
5.根據(jù)權利要求2所述的基因載體，其特征在于，所述的兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺與多肽的摩爾比為1:1-1:15。
6.根據(jù)權利要求5所述的基因載體，其特征在于，所述的兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺與多肽的摩爾比為1:2-1:10。
7.權利要求2-6任一所述的基因載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: Ca)合成權利要求1所述的多肽； (b)于兩親性殼聚糖中加入三光氣，溶于無水甲苯和無水二氯甲烷的溶劑中反應過夜，除去溶劑后再用適量溶劑溶解，加入N-羥基琥珀酰亞胺活化，將活化后的兩親性殼聚糖用二氯甲烷溶解，與無水乙醇溶解的聚乙烯亞胺混合，攪拌，偶聯(lián)得到兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺； (C)馬來酰亞胺化步驟(b)制備的兩親性殼聚糖修飾的聚乙烯亞胺，再加入步驟(a)合成的多肽，攪拌，偶聯(lián)。
8.權利要求2-6任一所述的基因載體與DNA形成的復合物。
9.根據(jù)權利要求8所述 的復合物，其特征在于，所述的DNA含報告基因、抗癌基因和/或細胞因子基因。
10.權利要求1所述的多肽以及權利要求2-6任一所述的基因載體在制備用于基因治療的藥物中的應用。
【文檔編號】C08G81/00GK103665169SQ201310587463
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權日:2013年11月21日
【發(fā)明者】劉克海, 朱曼曼, 呂慧, 趙文芳, 毛媛, 胡靜 申請人:上海海洋大學