基于kiss-1基因的豬繁殖性狀相關的分子標記及其檢測方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及動物分子育種領域，尤其設及一種基于KISS-I基因的豬繁殖性狀相關 的分子標記及其檢測方法和應用。
【背景技術】
[0002] 分子標記輔助選擇是基因工程在現(xiàn)代家畜育種中的一項重要應用，利用與育種性 狀相關的各種標記代替W表型為基礎的選擇，從分子水平上分析個體的遺傳組成，從而實 現(xiàn)對基因型的直接選擇，可克服直接選擇的弊端，提高選擇的準確性和縮短世代間隔。
[0003] 總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)等豬的繁殖性狀是重要的經(jīng)濟性狀，直接關系到養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng) 濟效益。
[0004] KISS-I基因是Lee JH等于1996年利用消減雜交的方法研究人黑瘤素細胞不同轉 移能力時發(fā)現(xiàn)并命名，具有抑制腫瘤轉移作用。人KISS-I基因被定位于lq32-41，包含4個外 顯子和3個內(nèi)含子，前2個外顯子不翻譯。KISS-I基因的編碼產(chǎn)物為kissp邱tin,是G蛋白偶 聯(lián)受體54(G protein-coupled receptor 54,GPR54)的配體，并組成KISS-1/GPR54系統(tǒng)。越 來越多的研究表明，KI S S -1 / G P R 5 4系統(tǒng)在哺乳動物初情期的啟動中起關鍵作用， kissp邱tin對下丘腦-垂體-性腺軸具有重要調(diào)控作用。目前，尚未見KISS-I基因與豬繁殖 性能關聯(lián)分析的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種基于KISS-I基因的豬 繁殖性狀相關的分子標記，為豬的分子育種提供新的思路，本發(fā)明的另一個目的是提供所 述分子標記的檢測方法和應用。
[0006] 技術方案:本發(fā)明所述的一種基于KISS-I基因的豬繁殖性狀相關的分子標記，它 為豬KISS-I基因片段，所述的豬KISS-I基因片段含有多態(tài)性位點，所述的多態(tài)性位點位于 豬KISS-I基因的核巧酸序列中第41位，所述的多態(tài)性位點具有G/T堿基的變異。
[0007] 豬KISS-I基因序列的核巧酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的多態(tài)性位點，與豬總 產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)緊密相關，可利用該位點開發(fā)與豬繁殖性狀相關的分子標記。本發(fā)明中， 描述多態(tài)性位點的位置時，W基因的轉錄起始點核巧酸位置為Ibp，上游為負，下游為正J員 次記數(shù)，第4化P位是指KISS-I基因的轉錄起始點開始的第4化P位，該位點處于SEQ ID NO.4 所示序列的第34化P位。
[000引本發(fā)明所述的豬KISS-I基因片段如SEQ ID NO. 1所示。當然，本發(fā)明所述的豬 KISS-I基因片段也可W為包含如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列的DNA片段。根據(jù)檢測方 法，可W選擇合適長度的能夠包含多態(tài)性位點的DNA片段。
[0009] 本發(fā)明還提供了所述分子標記的檢測方法，包括：
[0010] (1)根據(jù)所述的分子標記的核巧酸序列設計引物；
[0011] (2) W待檢測豬的基因組DNA為模板進行PCR擴增；
[001 ^ (3)判斷PCR擴增產(chǎn)物中多態(tài)性位點的類型。
[0013] 步驟(3)中，可對PCR產(chǎn)物進行測序或電泳分析，判斷多態(tài)性位點的堿基類型。
[0014] 優(yōu)選的，步驟(1)中，上游引物的核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核巧 酸序列如SEQ ID NO.3所示。利用該引物，可采用PCR-SSCP的方法準確方便的檢測多態(tài)性位 點的類型。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述的分子標記在豬繁殖性狀選擇中的應用。
[0016] 具體的，豬可W為小梅山豬、楓徑豬或大白豬。繁殖性狀為總產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)。
[0017] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0018] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，豬KISS-I基因第1外顯子存在一個突變位點（即多態(tài)性位點），該 位點位于豬KISS-I基因的核巧酸序列中第41位，該突變位點與豬的繁殖性狀尤其是總產(chǎn)仔 數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)相關，且容易檢測，從而本發(fā)明根據(jù)該突變位點提供了一種基于KISS-I基因 的豬繁殖性狀相關的分子標記，并提供了該分子標記的檢測方法及在豬繁殖性狀選擇中的 應用，為豬分子育種、研究豬繁殖生理機制提供基礎。
【附圖說明】
[0019]圖1為實施例1中PCR-SSCP檢測結果；
[0020] 圖2為實施例1中AA和BB基因型個體PCR產(chǎn)物測序結果；
[0021] 圖3為實施例1中AA和BB基因型個體的氨基酸比對結果。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。
[0023] 實施例1
[0024] 2013年采集106頭小梅山豬、42頭楓徑豬和70頭大白豬的耳樣；同時整理了江蘇農(nóng) 林職業(yè)技術學院小梅山豬育種中屯、2004年~2012年期間上述106頭小梅山母豬的生產(chǎn)檔 案，共有698窩仔豬記錄，主要收集產(chǎn)仔年份、胎次、TNB、NBA等指標。耳樣(約0.15g)用耳號 錯采集，-20°C凍存。用常規(guī)的酪氯仿抽提法提取豬基因組DNA，對基因組DNA進行OD值測定， 計算其濃度，并用d地2〇稀釋至終濃度為10化g/化，原液-20°C保存，稀釋液4°C保存，稀釋液 作為PCR擴增的模板。
[00巧]第一步:根據(jù)GenBank公布的豬KISS-I基因全序列(登錄號:NC_010451.2)，確定豬 KISS-I基因第1外顯子區(qū)域。
[0026] 第二步：采用Primers. 0軟件設計1對引物，擴增第1外顯子區(qū)域。引物為：KISS-1. 1。上游引物序列為：5'-gggctgttcacctcttgtct-3'（SEQ ID N0.2)，下游引物序列為：5'-邑邑。。。日日日旨日日日旨日日。日1。日-3'（沈9 10側.3)，擴增區(qū)域為-10769-7369(569 10側.1)，擴增 產(chǎn)物長度18化P。
[0027] 第S步:PCR-SSCP 檢測。
[002引 PCR擴增。PCR擴增反應體系為20化，包括：10 X Buffer 2.0化，25mM Mg2+2.2化， IOmM dNTPs 0.如L，10yM上、下游引物各化L，DNA模板化L(lOOng)，抓?化-iTaq酶0.2化， d地20 11.如UPCR擴增反應程序：94°C預變性5min;31個循環(huán)（94°C變性lmin，55°C退火 30s，72°C延伸lmin);最后72°C延伸10min，4°C保存產(chǎn)物。
[00巧]SSCP檢測程序為：2.5化PCR擴增產(chǎn)物和7.扣L上樣緩沖液混勻，98°C變性IOmin， 然后冰浴lOmin。變性后的PCR產(chǎn)物用10%的聚丙締酷胺凝膠120V電泳12h，銀染，拍照保存。 基因型分型結果見圖1，圖1中，泳道1、2、4的基因型為AA，泳道3、5、10、13的基因型為BB，泳 道6-9,11，12的基因型為AB。
[0030] 第四步:將AA和BB基因型個體的PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物公司進行測序，測序 結果見圖2。氨基酸比對結果顯示:G41T導致鄉(xiāng)氨酸(Val)變?yōu)楸奖彼?Phe),即V5F，見圖 3。
[0031] 第五步:分析該位點在不同豬群中的分布情況。結果參見表1，3個豬群中共檢測到 3種基因型與2個等位基因，小梅山豬與楓徑豬中等位基因 B為優(yōu)勢基因，基因頻率分別為 0.675、0.905，大白豬中，等位基因 A為優(yōu)勢基因，基因頻率為O . 843;經(jīng)^檢驗，小梅山豬在 KISS1-3位點上偏離哈代-溫伯格平衡狀態(tài)(P = O.006)，而楓徑豬與大白豬則處于哈代-溫 伯格平衡狀態(tài)(P〉〇.〇5)。
[0032] 表1 3個豬群KISS-I基因 G41T位點的基因型頻率與等位基因型頻率
[0033]

[0034] 第六步:SPSS軟件關聯(lián)分析該突變位點與繁殖性狀間的關系。結果參見表2,1~2 胎小梅山母豬中，AB型個體的TNB與NBA最高，分別為11.68頭、11.10頭，比AA與BB型個體分 別高0.68頭與0.39頭(P〉0.05)、0.50頭與0.45頭(P〉0.05)。2胎W上小梅山母豬中，AB型個 體的TNB為12.62頭、比AA型個體高2.74頭(P<0.0 l)，比BB型個體高0.27頭(P〉0.05);AB型個 體的NBA為11.93頭，比44、88型個體分別高2.58頭。<0.01)、0.40頭?！?.05)。所有胎次的 小梅山母豬中，AB型個體的TNB為12.39頭、比AA型個體高2.18頭(P<0.01)，比BB型個體高 0.31頭(P〉0.05);AB型個體的NBA為11.72頭，比AA、BB型個體分別高1.97頭(P<0.01)、0.40 頭(P<0.05)d3個階段中，3種基因型個體的TNB與NBA均表現(xiàn)出相同的趨勢:AB〉BB〉AA。
[0035] 表2 KISS-I基因 G41T位點與小梅山豬繁殖性狀的關聯(lián)分析
[0036]

[0037] 注:N為窩數(shù);TNB為總產(chǎn)仔數(shù);NBA為產(chǎn)活仔數(shù)
[0038] 結果提示:豬KISS-I基因 G41T位點雜合子繁殖性能優(yōu)于純合子，在選種時應加強 雜合子的選留。
【主權項】
1. 一種基于KISS-1基因的豬繁殖性狀相關的分子標記，其特征在于，它為豬KISS-1基 因片段，所述的豬Kiss-ι基因片段含有多態(tài)性位點，所述的多態(tài)性位點位于豬KISS-1基因 的核苷酸序列中第41位，所述的多態(tài)性位點具有G/T堿基的變異。2. 根據(jù)權利要求1所述的分子標記，其特征在于，所述的豬KISS-1基因片段包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。3. 根據(jù)權利要求2所述的分子標記，其特征在于，所述的豬KISS-1基因片段如SEQ ID NO. 1所示。4. 一種根據(jù)權利要求1~3任一項所述的基于KISS-1基因的豬繁殖性狀相關的分子標 記的檢測方法，其特征在于，包括： (1) 根據(jù)權利要求1~3任一項所述的分子標記的核苷酸序列設計引物； (2) 以待檢測豬的基因組DNA為模板進行PCR擴增； (3) 判斷PCR擴增產(chǎn)物中多態(tài)性位點的類型。5. 根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中，上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。6. -種根據(jù)權利要求1~3任一項所述的分子標記在豬繁殖性狀選擇中的應用。7. 根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，豬為小梅山豬、楓涇豬或大白豬。8. 根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，繁殖性狀為總產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于KISS?1基因的豬繁殖性狀相關的分子標記及其檢測方法和應用。所述的分子標記為豬KISS?1基因片段，所述的豬KISS?1基因片段含有多態(tài)性位點，所述的多態(tài)性位點位于豬KISS?1基因的核苷酸序列中第41位，所述的多態(tài)性位點具有G/T堿基的變異。本發(fā)明豬KISS?1基因第1外顯子存在一個突變位點，該位點位于豬KISS?1基因的核苷酸序列中第41位，該突變位點與豬的繁殖性狀尤其是總產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)相關，且容易檢測，從而本發(fā)明根據(jù)該突變位點提供了一種分子標記，并提供了該分子標記的檢測方法及在豬繁殖性狀選擇中的應用，為豬分子育種、研究豬繁殖生理機制提供基礎。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105713970
【申請?zhí)枴緾N201610144943
【發(fā)明人】吳井生, 陳永霞, 郭蘋, 陳超
【申請人】江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院