一種2-苯乙醇的生物制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種2-苯乙醇的生物制備方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]2-苯乙醇，又稱β-苯乙醇、二苯基乙醇，是一種具有玫瑰花香的芳香醇，其味淡雅細(xì)膩，多存在于玫瑰、水仙、百合、茉莉等植物精油中，2-苯乙醇也是面包、奶酪、餅干、葡萄酒等食品中的風(fēng)味物質(zhì)，該物質(zhì)在堿性環(huán)境以及對(duì)空氣的氧化作用穩(wěn)定，其衍生酯類物質(zhì)，如乙酸苯乙酯等也是重要的芳香產(chǎn)品。是一種具有玫瑰花香的芳香醇，其味淡雅細(xì)膩，多存在于玫瑰、水仙、百合、茉莉等植物精油中，2-苯乙醇也是面包、奶酪、餅干、葡萄酒等食品中的風(fēng)味物質(zhì)，該物質(zhì)在堿性環(huán)境以及對(duì)空氣的氧化作用穩(wěn)定，其衍生酯類物質(zhì)，如乙酸苯乙酯等也是重要的芳香產(chǎn)品。
[0003]目前生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2-苯乙醇的菌株主要集中在酵母。常見(jiàn)的2-苯乙醇酵母生產(chǎn)菌株包括:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，馬克斯克魯維酵母(KluyveromycesmarXianus)，解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)等。高濃度的2_苯乙醇(Log Pow =1.36)對(duì)微生物細(xì)胞有一定的毒性。研究表明濃度為2g/L的2-苯乙醇就能完全抑制馬克斯克魯維酵母的生長(zhǎng)(Fabre CE,Blanc PJ,Goma G.Product1n of 2-phenylethyl alcoholby Kluyveromyces marxianus[J].B1technol Prog，1998，14:270-274.);2.5g/L 2-苯乙醇能使得釀酒酵母生物量降低75%，3g/L 2-苯乙醇幾乎能完全抑制釀酒酵母菌株生長(zhǎng)(Seward RJ1Willets MG1Dinsdale,et al.The effects of ethanol,hexan-l-ol,and 2-phenylethanol on cider yeast growth,viability,and energy status；Synergisticinhibit1n[J].J I Brewing.1996,102(6):439-443.)。最終導(dǎo)致2-苯乙醇的產(chǎn)率較低，發(fā)酵液中2-苯乙醇的濃度大都低于4g/L。
[0004]產(chǎn)甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)是我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一株具有優(yōu)良發(fā)酵性能的工業(yè)菌株，能在55%葡萄糖或15%NaCl的高滲透壓培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)繁殖，具有耐高滲和高抗逆性的特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為解決上述的技術(shù)問(wèn)題，提供了一種以耐高滲透壓的產(chǎn)甘油假絲酵母為生產(chǎn)菌株生產(chǎn)2-苯乙醇的方法。
[0006]—種2-苯乙醇的生物制備方法，步驟如下:
[0007](I)挑取I環(huán)產(chǎn)甘油假絲酵母接入種子培養(yǎng)基中，在30°C，200r/min條件下，振蕩培養(yǎng)18h，得到液態(tài)種子。
[0008](2)將步驟(I)得到的液態(tài)種子按4% (v/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度為30 0C，轉(zhuǎn)速為500r/min，時(shí)間為50h，發(fā)酵結(jié)束。
[0009]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中種子培養(yǎng)基為酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水;根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基為L(zhǎng)-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2P04 5g/L，酵母粉4g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，余量為水。
[0010]本發(fā)明的有益效果:
[0011]1.本發(fā)明所選的產(chǎn)甘油假絲酵母菌株2-苯乙醇耐受性高，可達(dá)4g/L。進(jìn)一步克服了2-苯乙醇在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)菌株的毒害作用，有利于該菌株在2-苯乙醇工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0012]2.本發(fā)明所選的產(chǎn)甘油假絲酵母菌株具有2-苯乙醇產(chǎn)量高，轉(zhuǎn)化率高的特點(diǎn)，經(jīng)檢測(cè)，該菌株可利用7g/L的L-苯丙氨酸生成5g/L的苯乙醇，轉(zhuǎn)化率為0.71(g/g)。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1是產(chǎn)甘油假絲酵母在含不同濃度2-苯乙醇培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。
[0014]圖2是產(chǎn)甘油假絲酵母菌株產(chǎn)2-苯乙醇樣品的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用圖譜。a是產(chǎn)甘油假絲酵母菌株產(chǎn)2-苯乙醇樣品的氣相色譜圖；b是產(chǎn)甘油假絲酵母菌株產(chǎn)2-苯乙醇樣品的質(zhì)譜圖。
[0015]圖3是產(chǎn)甘油假絲酵母發(fā)酵合成2-苯乙醇的過(guò)程曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0017]實(shí)例I
[0018]挑取I環(huán)產(chǎn)甘油假絲酵母接入種子培養(yǎng)基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水)中，在30 0C，200r/min條件下，振蕩培養(yǎng)18h，得到液態(tài)種子。將得到的液態(tài)種子按4%(v/v)的接種量接入含有不同濃度的2-苯乙醇培養(yǎng)基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水)中，2-苯乙醇的濃度分別為Og/L，1.0g/L，2.0g/L，3.0g/L，3.5g/L，4.0g/L。裝液量為50mL/250mL，控制培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為200r/min，在不同時(shí)間取樣測(cè)定酵母的生長(zhǎng)量0D6Q()(附圖1)。
[0019]實(shí)例2
[0020]挑取I環(huán)產(chǎn)甘油假絲酵母接入種子培養(yǎng)基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水)中，在30 0C，200r/min條件下，振蕩培養(yǎng)18h，得到液態(tài)種子。將得到的液態(tài)種子按4%(v/v)的接種量接入接入發(fā)酵培養(yǎng)基(L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2PO4 5g/L，無(wú)氨基酸酵母氮源YNB 0.17g/L,MgSO4.7H20 0.5g/L，余量為水)中，裝液量為30mL/250mL，控制發(fā)酵溫度為30 V，轉(zhuǎn)速為200r/min，時(shí)間為50h，發(fā)酵結(jié)束。
[0021]產(chǎn)物確認(rèn)采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)，將實(shí)施例2制得的發(fā)酵液4°C，10，000r/m離心lOmin，取上清液于分液漏斗，加入相同體積的正戊烷與環(huán)己烷的混合溶液(2:1，v: V)混勻，萃取過(guò)夜，將有機(jī)相添加無(wú)水硫酸鈉脫水，取上清液供氣-質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)。
[0022]氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)儀(BrokerSC1N SQ，USA)，色譜柱DB-wax，( 30m X
0.25mm，0.25ym)，進(jìn)樣量0.2yL，載氣為He，流速0.8mL/min，進(jìn)樣口溫度為260 °C，柱溫箱起始溫度為50°C，保留lmin，以10°C/min程序升溫至230°C，保留5min至終點(diǎn)。連接桿溫度250°C，質(zhì)量掃描范圍33-400m/z，電離電壓70eV。使用Nist 98譜庫(kù)進(jìn)行圖譜檢索。質(zhì)譜離子圖解析結(jié)果附圖2所示。
[0023]實(shí)例3
[0024]挑取I環(huán)產(chǎn)甘油假絲酵母接入種子培養(yǎng)基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水)中，在30 0C，200r/min條件下，振蕩培養(yǎng)18h，得到液態(tài)種子。將得到的液態(tài)種子按4%(v/v)的接種量接入接入含有2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基(L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2PO4 5g/L，酵母粉4g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，余量為水)的5L發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度為30 0C，轉(zhuǎn)速為500r/min，時(shí)間為50h，發(fā)酵結(jié)束。
[0025]發(fā)酵液中2-苯乙醇的測(cè)定方法，采用高效液相色譜法(HPLC)分析，具體如下:將發(fā)酵液10，000r/min離心，離心后再用0.45μηι微孔濾膜過(guò)濾處理，高效液相色譜儀(Agilent,USA)，色譜柱為C18柱(250mmX 4.6mm，10ym；Ailite，中國(guó))，流動(dòng)相為甲醇:水=50:50(v/V)，流動(dòng)相流速0.7mL/min，柱溫30°C，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，進(jìn)樣1yL檢測(cè)。發(fā)酵結(jié)束后2-苯乙醇的濃度為5g/L(附圖3)，轉(zhuǎn)化率為0.71(g/g)。
[0026]以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說(shuō)明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種2-苯乙醇的生物制備方法，其特征在于，通過(guò)選取耐高滲透壓的產(chǎn)甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)，轉(zhuǎn)化L-苯丙氛酸發(fā)酵生產(chǎn)2_苯乙醇。2.如權(quán)利要求1所述2-苯乙醇的制備方法，其特征在于，所述的酵母菌株為耐高滲透壓，同時(shí)對(duì)2-苯乙醇的耐受性可達(dá)4g/L的產(chǎn)甘油假絲酵母。3.如權(quán)利要求1或2所述2-苯乙醇的制備方法，步驟如下: (1)挑取I環(huán)產(chǎn)甘油假絲酵母接入種子培養(yǎng)基中，在30°C，200r/min條件下，振蕩培養(yǎng)18h，得到液態(tài)種子。 (2)將步驟(I)得到的液態(tài)種子按4%(v/v)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度為30 0C，轉(zhuǎn)速為500r/min，時(shí)間為50h，發(fā)酵結(jié)束。4.如權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述步驟(I)中種子培養(yǎng)基為酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量為水。5.如權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)基為L(zhǎng)-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2P04 5g/L，酵母粉4g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，余量為水。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種2?苯乙醇的生物制備方法。即選取耐高滲透壓的產(chǎn)甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)轉(zhuǎn)化L?苯丙氨酸發(fā)酵生產(chǎn)2?苯乙醇。該酵母對(duì)2?苯乙醇的耐受性可達(dá)4g/L，有效克服了2?苯乙醇對(duì)宿主生產(chǎn)菌的生長(zhǎng)抑制，2?苯乙醇的產(chǎn)量達(dá)到5g/L、轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.71(g/g)。本發(fā)明的制備方法具有操作方便、轉(zhuǎn)化效率高、生產(chǎn)成本低、工業(yè)化應(yīng)用前景廣等特點(diǎn)。
【IPC分類】C12R1/72, C12P7/22
【公開(kāi)號(hào)】CN105713933
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610256845
【發(fā)明人】諸葛斌, 王玉芹, 陸信曜, 宗紅
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)