本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程改造領(lǐng)域，具體涉及一種芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶突變體蛋白。

背景技術(shù)：

1、芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（aromatic?isoprene?transferases?;?ec?2.5.1.74）是指以芳香類化合物為底物，異戊烯基化合物為側(cè)鏈，使二者發(fā)生烷基化反應(yīng)形成c-c鍵，從而形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的具有生物活性的物質(zhì)-----芳香類異戊烯基化合物。目前，有關(guān)于芳香類異戊烯基化合物的制備方法有化學(xué)合成法和生物合成法，其中酶法生物合成是目前研究的一個主要方向。從天然能夠合成異戊烯基芳香類化合物的生物中克隆其中的相關(guān)基因，通過對其進(jìn)行外源表達(dá)以及構(gòu)建芳香類化合物異戊烯基轉(zhuǎn)移酶工程微生物及其突變體，由此對芳香類化合物進(jìn)行定向異戊烯基化。芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶目前在細(xì)菌、真菌及植物中均有發(fā)現(xiàn)，其參與甲萘醌、泛醌、生育酚等次級代謝產(chǎn)物的合成。關(guān)于芳香族異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的分類，主要分為兩種，一種是膜結(jié)合型的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，另一種是不含異戊烯基結(jié)合區(qū)（n/d）dxxd的可溶性蛋白。同時微生物來源芳香類化合物異戊烯基轉(zhuǎn)移酶具有廣泛的底物選擇性。通過對芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究和酶功能鑒定，為異戊烯基芳香類化合物的合成提供更全新的方法。

2、定點突變是指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）等方法向編碼目的蛋白的dna片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點突變等。定點突變能迅速、高效的提高dna所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。體外定點突變技術(shù)是當(dāng)前生物、醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域研究中的一種重要實驗手段，是改造、優(yōu)化基因的便捷方案，也是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具。對某個已知基因的特定堿基進(jìn)行定點改變、缺失或者插入，可以改變對應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對突變基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研究有助于人類了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域。定點突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，如研究蛋白質(zhì)相互作用位點的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動力學(xué)特性、提高蛋白的穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，以及基因治療等。酶的定點突變技術(shù)為酶的結(jié)構(gòu)和功能開辟了嶄新的途徑，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域取得巨大成功。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問題提供了一種酶活力得到顯著提高的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶突變體。所述突變體是由枯草芽孢桿菌( bacillus?subtilis)芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因mena出發(fā)，運用定點突變技術(shù)獲得的，并在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)。

2、本發(fā)明一方面提供了一種芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶突變體，是氨基酸序列為seq?idno:1的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena的第67位氨基酸由gln變?yōu)閠yr，突變體氨基酸序列為seq?id?no:2。

3、本發(fā)明一方面提供了一種芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶突變體，其相對于野生型的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena的氨基酸序列中第67氨基酸由gln變?yōu)閠yr，突變后的氨基酸序列如seq?id?no:2所示；

4、或其相對于野生型的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena的氨基酸序列中第22氨基酸由leu變?yōu)閜he，突變后的氨基酸序列如seq?id?no:3所示；

5、或其相對于野生型的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena的氨基酸序列中第?102氨基酸由pro變?yōu)閘eu，突變后的氨基酸序列如seq?id?no:4所示；

6、或其相對于野生型的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena的氨基酸序列中第?185位氨基酸由gln變?yōu)?tyr，突變后的氨基酸序列如seq?id?no:5所示；

7、或其相對于野生型的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena的氨基酸序列中第?268?氨基酸由val變?yōu)閜he，突變后的氨基酸序列如seq?id?no:6所示；

8、或其相對于野生型的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena的氨基酸序列中第60位氨基酸由leu?變?yōu)?ile，突變后的氨基酸序列如seq?id?no:7所示。

9、進(jìn)而本發(fā)明提供一種芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena突變體編碼基因，其編碼所述的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena突變體。

10、更進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體，其所述的重組表達(dá)載體攜帶有編碼所述的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena突變體的基因；優(yōu)選地其出發(fā)表達(dá)載體pdg1730是由啟動子pglv或者pcspd或者pcspb啟動，整合位點是amye或者ldh或者apre，所述重組表達(dá)載體優(yōu)選啟動子pglv，整合位點amye。

11、本發(fā)明也提供一種重組宿主細(xì)胞，所述的重組宿主細(xì)胞為轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

12、優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞為枯草芽孢桿菌( bacillus?subtilis)。

13、本發(fā)明更進(jìn)一步提供所述的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena突變體或其編碼基因在制備七烯甲萘醌中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明還提供一種制備七烯甲萘醌的方法，其培養(yǎng)如權(quán)利要求3或4所述的重組宿主細(xì)胞以產(chǎn)生七烯甲萘醌。優(yōu)選地，還包括收集和純化七烯甲萘醌的步驟。

15、具體地，培養(yǎng)時采用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：甘油3％，大豆蛋白胨6％，酵母粉0.5％，k2hpo4?0.3％，mgso4?·7h2o?0.5％，l-?tryptophan?0.1％，麥芽糖3%。

16、優(yōu)選地，培養(yǎng)時條件為40?℃、200?rpm振蕩培養(yǎng)96?h。

17、更優(yōu)選地，在避光條件，所述收集是向發(fā)酵液中加入4倍體積的異丙醇：正己烷=1:2的萃取液，振蕩15min以上；然后靜置，分層后吸取上清液即得。

18、本發(fā)明以來源于枯草芽孢桿菌的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena為基礎(chǔ)，通過定點突變技術(shù)獲得了六個芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶突變體mena-1、mena-2和mena-3、mena-4、mena-5、mena-6，并在枯草芽孢桿菌中對上述突變體進(jìn)行了發(fā)酵，其發(fā)酵七烯甲萘醌的產(chǎn)量分別為64.49?mg/l、69.30?mg/l、83.86?mg/l、105.84?mg/l、119.23?mg/l和125.45?mg/l，分別是表達(dá)野生型芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena的枯草芽孢桿菌七烯甲萘醌產(chǎn)量的133%、143%、173%、219%、246%和259%。

技術(shù)特征：

1.一種芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena突變體，其特征在于，其相對于野生型的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena的氨基酸序列中第67氨基酸由gln變?yōu)閠yr，突變后的氨基酸序列如seqid?no:2所示；

2.一種芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena突變體編碼基因，其編碼權(quán)利要求?1所述的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena突變體。

3.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體攜帶有編碼權(quán)利要求?1所述的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena突變體的基因；優(yōu)選地其出發(fā)表達(dá)載體pdg1730是由啟動子pglv或者pcspd或者pcspb啟動，整合位點是amye或者ldh或者apre，所述重組表達(dá)載體優(yōu)選啟動子pglv，整合位點amye。

4.一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的重組宿主細(xì)胞為轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞為枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)。

5.權(quán)利要求?1所述的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mena突變體或其編碼基因在制備七烯甲萘醌中的應(yīng)用。

6.一種制備七烯甲萘醌的方法，其特征在于，培養(yǎng)如權(quán)利要求3所述的重組宿主細(xì)胞以產(chǎn)生七烯甲萘醌。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括收集和純化七烯甲萘醌的步驟。

8.?如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)時采用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：甘油3％，大豆蛋白胨6％，酵母粉0.5％，k2hpo4?0.3％，mgso4?·7h2o?0.5％，l-?tryptophan?0.1％，麥芽糖3%。

9.?如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)時條件為40?℃、200?rpm振蕩培養(yǎng)96h。

10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在避光條件，所述收集是向發(fā)酵液中加入4倍體積的異丙醇：正己烷=1:2的萃取液，振蕩15min以上；然后靜置，分層后吸取上清液即得。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶突變體，是以來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因MenA為基礎(chǔ)，通過定點突變PCR技術(shù)獲得了六個芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶突變體MenA?1至MenA?6，并分別構(gòu)建了表達(dá)上述突變體的重組菌枯草芽孢桿菌，其發(fā)酵七烯甲萘醌的產(chǎn)量分別為64.49?mg/L、69.30?mg/L、83.86?mg/L、105.84?mg/L、119.23?mg/L和125.45?mg/L，分別是表達(dá)野生型芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶MenA的枯草芽孢桿菌七烯甲萘醌產(chǎn)量的133%、143%、173%、219%、246%和259%。

技術(shù)研發(fā)人員：張大偉,付剛,黃未
受保護的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21