本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程改造領(lǐng)域，具體涉及一種新型的sephchc合酶突變體蛋白。

背景技術(shù)：

1、2-琥珀酰-5-烯醇丙酮基-6-羥基-3-環(huán)己烯-1-羧酸（sephchc）合酶，也稱為mend（ec?2.2.1.9）。該酶是一種硫胺素二磷酸（thdp）依賴性的脫羧酶，催化α-酮戊二酸鹽和異溴酸鹽生成sephchc，其催化反應(yīng)的特點(diǎn)是高化學(xué)和區(qū)域選擇性。硫胺素二磷酸（thdp）依賴酶通常在催化過(guò)程中將缺乏電子的羰基底物轉(zhuǎn)化為親核試劑。mend是甲基萘醌和葉綠醌生物合成所必需的，存在于多種細(xì)菌的基因組中。在日用化學(xué)品、食品加工、醫(yī)藥合成等領(lǐng)域廣泛使用，是生物技術(shù)和醫(yī)療應(yīng)用的有前途的靶點(diǎn)。

2、定點(diǎn)突變是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）等方法向編碼目的蛋白的dna片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。定點(diǎn)突變能迅速、高效的提高dna所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。體外定點(diǎn)突變技術(shù)是當(dāng)前生物、醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域研究中的一種重要實(shí)驗(yàn)手段，是改造、優(yōu)化基因的便捷方案，也是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具。對(duì)某個(gè)已知基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或者插入，可以改變對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對(duì)突變基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研究有助于人類了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/結(jié)構(gòu)域。定點(diǎn)突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，如研究蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動(dòng)力學(xué)特性、提高蛋白的穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，以及基因治療等。酶的定點(diǎn)突變技術(shù)為酶的結(jié)構(gòu)和功能開(kāi)辟了嶄新的途徑，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域取得巨大成功。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題提供了一種酶活力得到顯著提高的sephchc合酶突變體。所述突變體是由枯草芽孢桿菌( bacillus?subtilis)?sephchc合酶基因mend出發(fā)，運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得的，并在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)。

2、本發(fā)明提供一種sephchc合酶突變體，其氨基酸序列為seq?id?no:1的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mend的第117位氨基酸由gln變?yōu)閍la，突變體的氨基酸序列為seq?id?no:2；

3、或者其氨基酸序列為seq?id?no:1的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mend的第181位氨基酸由leu變?yōu)閍sn，突變體氨基酸序列為seq?id?no:3；

4、或者其氨基酸序列為seq?id?no:1的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mend的第88位氨基酸由ala變?yōu)閕le，突變體氨基酸序列為seq?id?no:4；

5、或者其氨基酸序列為seq?id?no:1的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mend的第112位氨基酸由glu變?yōu)閜ro，突變體氨基酸序列為seq?id?no:5；

6、或者其氨基酸序列為seq?id?no:1的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mend的第493位氨基酸由leu變?yōu)閍rg，突變體氨基酸序列seq?id?no:6；

7、或者其氨基酸序列為seq?id?no:1的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mend的第115位氨基酸由ala變?yōu)閠yr，突變體氨基酸序列為seq?id?no:7。

8、本發(fā)明還提供一種sephchc合酶突變體編碼基因，其編碼所述的sephchc合酶突變體。

9、本發(fā)明進(jìn)一步提供一種重組表達(dá)載體，其所述的重組表達(dá)載體攜帶有權(quán)利要求?1所述的sephchc合酶突變體的編碼基因。

10、優(yōu)選地，其出發(fā)表達(dá)載體是pdh1730，且所述編碼基因是由啟動(dòng)子pglv或者pcspd或者pcspb啟動(dòng)。更優(yōu)選地，所述編碼基因整合位點(diǎn)是amye或者ldh或者apre。

11、最優(yōu)選地，所述編碼基因是啟動(dòng)子pcspd啟動(dòng)，且整合位點(diǎn)為ldh。

12、本發(fā)明提供一種重組宿主細(xì)胞，所述的重組宿主細(xì)胞為轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，優(yōu)選地所述的宿主細(xì)胞為枯草芽孢桿菌( bacillus?subtilis)。

13、本發(fā)明也提供所述的sephchc合酶突變體或其編碼基因在制備七烯甲萘醌中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明因此也提供一種制備七烯甲萘醌的方法，其培養(yǎng)所述的重組宿主細(xì)胞以產(chǎn)生七烯甲萘醌。

15、優(yōu)選地，還包括收集和純化七烯甲萘醌的步驟；更優(yōu)選地，培養(yǎng)時(shí)采用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：甘油3％，大豆蛋白胨6％，酵母粉0.5％，k2hpo4?0.3％，mgso4??7h2o?0.5％，l-tryptophan?0.1％，麥芽糖3%；培養(yǎng)時(shí)條件為40?℃、200?rpm振蕩培養(yǎng)96?h。

16、本發(fā)明以來(lái)源于枯草芽孢桿菌的sephchc合酶mend為基礎(chǔ)，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了六個(gè)sephchc合酶突變體mend-1、mend-2、mend-3、mend-4、mend-5和mend-6，并在枯草芽孢桿菌中對(duì)上述突變體進(jìn)行了發(fā)酵，其發(fā)酵七烯甲萘醌的產(chǎn)量分別為70.77?mg/l、75.48mg/l、81.72?mg/l、88.41?mg/l?、99.88?mg/l和133.40?mg/l，分別是表達(dá)野生型sephchc合酶mend的枯草芽孢桿菌七烯甲萘醌產(chǎn)量的116%、123%、134%、144%、162%和218%。

技術(shù)特征：

1.一種sephchc合酶突變體，其氨基酸序列為seq?id?no:1的芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶mend的第117位氨基酸由gln變?yōu)閍la，突變體的氨基酸序列為seq?id?no:2；

2.一種sephchc合酶突變體編碼基因，其編碼權(quán)利要求?1所述的sephchc合酶突變體。

3.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體攜帶有權(quán)利要求?1所述的sephchc合酶突變體的編碼基因。

4.如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，其出發(fā)表達(dá)載體是pdh1730，且所述編碼基因是由啟動(dòng)子pglv或者pcspd或者pcspb啟動(dòng)。

5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述編碼基因整合位點(diǎn)是amye或者ldh或者apre。

6.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述編碼基因是啟動(dòng)子pcspd啟動(dòng)，且整合位點(diǎn)為ldh。

7.一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的重組宿主細(xì)胞為轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，優(yōu)選地所述的宿主細(xì)胞為枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)。

8.權(quán)利要求?1所述的sephchc合酶突變體或其編碼基因在制備七烯甲萘醌中的應(yīng)用。

9.一種制備七烯甲萘醌的方法，其特征在于，培養(yǎng)如權(quán)利要求7所述的重組宿主細(xì)胞以產(chǎn)生七烯甲萘醌。

10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，還包括收集和純化七烯甲萘醌的步驟；優(yōu)選地，培養(yǎng)時(shí)采用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：甘油3％，大豆蛋白胨6％，酵母粉0.5％，k2hpo40.3％，mgso4??7h2o?0.5％，l-?tryptophan?0.1％，麥芽糖3%；培養(yǎng)時(shí)條件為40?℃、200rpm振蕩培養(yǎng)96?h。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶突變體，以來(lái)源于枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)SEPHCHC合酶基因MenD為基礎(chǔ)，通過(guò)定點(diǎn)突變PCR技術(shù)獲得了六個(gè)芳香類異戊烯基轉(zhuǎn)移酶突變體MenD?1、MenD?2、MenD?3、MenD?4、MenD?5和MenD?6，并分別構(gòu)建了表達(dá)上述突變體的重組菌枯草芽孢桿菌，其發(fā)酵七烯甲萘醌的產(chǎn)量分別為70.77?mg/L、75.48?mg/L、81.72?mg/L、88.41?mg/L、99.88?mg/L和133.40?mg/L，分別是表達(dá)野生型SEPHCHC合酶MenD的枯草芽孢桿菌七烯甲萘醌產(chǎn)量的116%、123%、134%、144%、162%和218%。

技術(shù)研發(fā)人員：張大偉,付剛,黃未
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21