本發(fā)明涉及一種催化活性和熱穩(wěn)定性提高的石莼多糖裂解酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程。

背景技術(shù)：

1、綠藻是三大藻類之一，相較于紅藻和褐藻，綠藻相關(guān)研究及報道較少，這說明綠藻仍未被充分開發(fā)和利用。石莼多糖是綠藻細胞壁的主要成分，是一種水溶性多糖，約占總藻干重的8％到29％。石莼多糖的結(jié)構(gòu)主要由硫酸化鼠李糖(rha3s)、葡萄糖醛酸(glca)、艾杜糖醛酸(idoa)和木糖(xyl)組成。由于艾杜糖醛酸和硫酸化鼠李糖的存在使石莼多糖與其他海洋來源的多糖不同，顯示出與哺乳動物糖胺聚糖(如硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸)的相似性，因此石莼多糖及其降解后的石莼寡糖具有抗氧化、抗菌、抗病毒和降血糖等多種作用，其在生物醫(yī)藥行業(yè)有廣泛的應(yīng)用價值。另外石莼多糖及寡糖在能源、以及農(nóng)作物保護方面都有潛在的應(yīng)用價值，近年來得到越來越多的關(guān)注。因此加強對石莼多糖的開發(fā)一方面可以生產(chǎn)高附加值產(chǎn)物，帶來新的經(jīng)濟增長點，同時可以減輕因綠藻的富營養(yǎng)化引起的水質(zhì)污染。

2、與物理、化學方法相比，生物酶解法提取石莼多糖具有高效綠色，條件溫和，專一性強等優(yōu)點。石莼多糖裂解酶可以通過β-消除機制將石莼多糖降解為小分子石莼寡糖。在工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用中，提高反應(yīng)溫度有利于提高反應(yīng)速率，降低成本。因此，研發(fā)高效及穩(wěn)定性較高的酶具有重要的意義。

3、目前蛋白質(zhì)工程是提高酶活及熱穩(wěn)定性的主要手段。包括隨機進化、半理性設(shè)計及理性設(shè)計等。隨機進化往往工作量大，存在結(jié)果不確定性等劣勢?；诘鞍踪|(zhì)的序列及結(jié)構(gòu)的改造方法更具有針對性，通過引入計算模擬等篩選方法，干濕實驗的結(jié)合可以更高效的篩選出優(yōu)勢突變體，降低成本等。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為提高石莼多糖裂解酶的熱穩(wěn)定性和催化活性，通過對石莼多糖裂解酶的非保守loop區(qū)進行改造，利用foldx計算篩選熱點殘基，進行飽和突變獲得熱穩(wěn)定性和催化活性提升的單點突變體，進一步組合突變，提高酶的催化性能。

2、實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)路線概述如下：

3、基于序列和結(jié)構(gòu)比對，選擇石莼多糖裂解酶的非保守loop區(qū)殘基，利用foldx計算δδg值變化，確定了熱點區(qū)域。在對應(yīng)于seq?id?no：1的q207、t91位或d81位殘基進行飽和突變。在以獲得的熱穩(wěn)定性和催化活性提升的n35p的基礎(chǔ)上，獲得雙突變體，其中n35p/q207m突變體相對酶活為野生型的1.51倍，最適溫度提高10℃，在40℃下孵育2h后，野生型酶活幾乎喪失，突變體殘余酶活為76％，約是野生型的10.8倍。

4、本發(fā)明的第一個目的是提供一種結(jié)合foldx篩選熱點突變殘基的方法，所述的突變體是以氨基酸序列如seq?id?no.1所示的石莼多糖裂解酶為親本，進行飽和突變和組合突變改造，得到催化效率明顯提升的突變體。

5、本發(fā)明的第二個目的是構(gòu)建一種重組表達載體用以表達突變體酶的工程菌株。

6、本發(fā)明的第三個目的是上述重組菌株的應(yīng)用，特別是在生產(chǎn)石莼多糖裂解酶中的應(yīng)用。進一步地，所述的應(yīng)用是采用石莼多糖裂解酶突變體降解石莼多糖。

技術(shù)特征：

1.一種石莼多糖裂解酶突變體，其特征在于，所述的石莼多糖裂解酶突變體是在氨基酸序列如seq?id?no：1所示的q207，t91位或d81c位中的至少一個位置的氨基酸殘基發(fā)生突變，或者上述單點突變體與酶活和熱穩(wěn)定性提升的n35p組合的雙突變體。

2.權(quán)利要求1所述的石莼多糖裂解酶突變體的編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no：2所示的基因序列。

3.一種攜帶權(quán)利要求2所述的基因的表達載體。

4.一種表達權(quán)利要求1所述的石莼多糖裂解酶突變體的重組菌。

5.如權(quán)利要求4所述宿主細胞，其特征在于，所述的重組菌是大腸桿菌bl21或大腸桿菌jm109。

6.權(quán)利要求1所述的石莼多糖裂解酶突變體在醫(yī)藥、生物、化工等行業(yè)的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用是采用石莼多糖裂解酶突變體降解石莼多糖為石莼寡糖。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種石莼多糖裂解酶的突變體，具有熱穩(wěn)定性和催化活性提高的特點，屬于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。通過對蛋白質(zhì)序列進行比對和結(jié)構(gòu)分析，計算蛋白質(zhì)的非保守區(qū)域loop區(qū)殘基，并在先前獲得的優(yōu)勢突變體基礎(chǔ)上，定點飽和突變和組合突變，進一步提高了酶的催化活性和熱穩(wěn)定性。

技術(shù)研發(fā)人員：劉夫鋒,黃愛嵐,陳政企
受保護的技術(shù)使用者：天津科技大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21