：本發(fā)明屬生物，涉及原代脂肪干細(xì)胞的分離，具體涉及一種高效成脂分化的脂肪干細(xì)胞及其制備方法，本發(fā)明使所述脂肪干細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。

背景技術(shù)

0、
背景技術(shù)：

1、現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)的研究表明，肥胖與眾多代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如糖尿病、脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化及腫瘤。肥胖是指人體脂肪的過(guò)量存儲(chǔ)，表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞體積增大和數(shù)目增多，其中脂肪細(xì)胞數(shù)目的增多主要由存在于脂肪組織中的脂肪干細(xì)胞增殖分化為成熟的脂肪細(xì)胞，因此，脂肪干細(xì)胞分化機(jī)制研究以及分化后的成熟脂肪細(xì)胞功能研究成為生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

2、2001年zuk首次通過(guò)膠原酶消化離心的方法得到血管基質(zhì)成分(stromalvascular?fraction,svf)，并證明這群細(xì)胞具有多潛能性。隨著流式技術(shù)以及單細(xì)胞測(cè)序方法的進(jìn)步，研究者發(fā)現(xiàn)脂肪組織除了含有成熟的脂肪細(xì)胞,還包含不同類型的脂肪干細(xì)胞、血管相關(guān)細(xì)胞以及免疫細(xì)胞。研究顯示，脂肪組織在應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩時(shí)，皮下脂肪細(xì)胞首先出現(xiàn)脂肪細(xì)胞體積增大，12周后才會(huì)出現(xiàn)新生的脂肪細(xì)胞。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，dpp4+(dipeptidyl?peptidase–4–expressing)細(xì)胞是一種早期多潛能細(xì)胞，具有更高的增值和分化潛能；icam1+(intercellular?adhesion?molecule–1–expressing)細(xì)胞是定向后的前脂肪細(xì)胞，更容易向成熟的脂肪細(xì)胞分化。通過(guò)流式分選可以獲得相對(duì)單一的脂肪干細(xì)胞亞群，作為后期研究的細(xì)胞模型，但流式分選效率低、費(fèi)用高、易污染，不便作為常規(guī)的細(xì)胞亞群獲取方式。

3、研究顯示，脂肪組織中存在豐富的血管，用來(lái)提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；同時(shí)，也能提供干細(xì)胞，用于分化為成熟的脂肪細(xì)胞。khanh-van?tran在2012年用免疫電鏡等技術(shù)從形態(tài)上發(fā)現(xiàn)白色脂肪細(xì)胞和棕色脂肪細(xì)胞可能來(lái)源于內(nèi)皮外的一群周細(xì)胞，進(jìn)一步用ve-cadherin啟動(dòng)子追蹤發(fā)現(xiàn)，這些陽(yáng)性細(xì)胞可以發(fā)育分化為前脂肪細(xì)胞、成熟的脂肪細(xì)胞。2020年通過(guò)譜系示蹤的方法，發(fā)現(xiàn)血管周pdgfrβ+的干細(xì)胞可以發(fā)育分化為成熟的脂肪細(xì)胞，但在體內(nèi)卻發(fā)揮著抑制脂肪分化的功能。本研究團(tuán)隊(duì)之前的研究工作發(fā)現(xiàn)在用膠原酶進(jìn)行消化脂肪組織的過(guò)程中，可以得到毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，并證明這些成分包含血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，但隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，血管樣結(jié)構(gòu)逐漸減少。

4、基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請(qǐng)的發(fā)明人試圖用一種簡(jiǎn)易的方式獲取相對(duì)單一的脂肪前體細(xì)胞，使其在體外達(dá)到95％以上的分化效率，為后期的脂肪代謝研究提供有效的細(xì)胞模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明的目的是要解決脂肪干細(xì)胞的體外成脂分化效率不高，導(dǎo)致難以在體外建立穩(wěn)定的原代脂肪干細(xì)胞成脂分化方案，具體涉及原代脂肪干細(xì)胞及其分離方法，尤其涉及一種高效成脂分化的脂肪干細(xì)胞及其制備方法并使其分化為成熟的脂肪細(xì)胞。

2、本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)易的方式獲取相對(duì)單一的脂肪前體細(xì)胞，使其在體外達(dá)到95％以上的分化效率，為后期的脂肪代謝研究提供有效的細(xì)胞模型。

3、本發(fā)明提供了高效成脂分化的脂肪干細(xì)胞的制備方法，其采用以下技術(shù)方案及步驟：

4、1)無(wú)菌獲取雄性小鼠腹股溝脂肪組織；

5、2)使用pbs洗滌脂肪組織后，加入pbs剪碎；

6、3)再加入0.1％膠原酶消化液，40分鐘后離心去除上層脂質(zhì)和消化液，保留下層沉淀；

7、4)在沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液，打散細(xì)胞，離心去除上清，剩余沉淀加入培養(yǎng)基混勻，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中進(jìn)行原代p1培養(yǎng)；

8、5)細(xì)胞接觸抑制后2天，定義為day?0，加入誘導(dǎo)劑8天后獲得成熟的脂肪細(xì)胞。

9、本發(fā)明中，膠原酶消化40分鐘得到間充質(zhì)細(xì)胞群，剩余毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)采用微滴法培養(yǎng)擴(kuò)增為血管相關(guān)成分。

10、本發(fā)明所制備的脂肪干細(xì)胞可以在體外高效分化為成熟的脂肪細(xì)胞。

11、本發(fā)明所制備的脂肪干細(xì)胞體外成脂分化能力達(dá)到90％以上。

12、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，

13、本發(fā)明為達(dá)到高效成脂分化比例，通過(guò)優(yōu)化體外分離方案，比較膠原酶消化時(shí)間40-60min，使脂肪干細(xì)胞在體外成脂分化，用膠原酶消化40min后的脂肪干細(xì)胞成脂分化能力明顯優(yōu)于60min；進(jìn)一步，通過(guò)簡(jiǎn)易的方式獲取脂肪組織血管基質(zhì)成分中的兩部分：間充質(zhì)細(xì)胞和血管相關(guān)細(xì)胞，體外成脂分化后顯示只有間充質(zhì)細(xì)胞有成脂分化能力，而血管相關(guān)細(xì)胞在體外沒(méi)有成脂分化能力。

14、本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)易的方式獲取脂肪組織中的兩種成分，并經(jīng)縮短膠原酶消化時(shí)間可獲得成脂分化能力更強(qiáng)的脂肪干細(xì)胞，將進(jìn)一步有助于為肥胖相關(guān)的代謝性疾病提供可靠的原代細(xì)胞培養(yǎng)分化模型，為個(gè)性化的精準(zhǔn)醫(yī)療提供穩(wěn)定的體外原代分離培養(yǎng)方案。

技術(shù)特征：

1.高效成脂分化的脂肪干細(xì)胞，其特征在于，采用下述方法和步驟制備：

2.按權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞，其特征在于，所述的制備方法中，膠原酶消化40分鐘得到間充質(zhì)細(xì)胞群，剩余毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)采用微滴法培養(yǎng)擴(kuò)增為血管相關(guān)成分。

3.按權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞，其特征在于，所述的脂肪干細(xì)胞在體外高效分化為成熟的脂肪細(xì)胞。

4.按權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞，其特征在于，所述的脂肪干細(xì)胞體外成脂分化能力達(dá)到90％以上。

5.按權(quán)利要求2所述的所述的脂肪干細(xì)胞，其特征在于，所述的間充質(zhì)細(xì)胞群有高效的體外成脂分化能力，所述的血管相關(guān)成分無(wú)體外成脂分化能力。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及原代脂肪干細(xì)胞的分離，具體涉及一種高效成脂分化的脂肪干細(xì)胞及其制備方法，本發(fā)明使所述脂肪干細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)嚴(yán)格控制膠原酶的消化時(shí)間，最終得到高表達(dá)前脂肪干細(xì)胞相關(guān)基因的間充質(zhì)細(xì)胞群，去除抑制脂肪細(xì)胞分化的血管相關(guān)細(xì)胞，從而使分離得到的細(xì)胞群具有90％以上的體外成脂分化能力。本發(fā)明能解決脂肪干細(xì)胞的體外成脂分化效率不高，導(dǎo)致難以在體外建立穩(wěn)定的原代脂肪干細(xì)胞成脂分化方案，有望為肥胖相關(guān)的代謝性疾病的研究提供穩(wěn)定的原代細(xì)胞。

技術(shù)研發(fā)人員：湯妍,尹峰,張傳宇,宋賽賽
受保護(hù)的技術(shù)使用者：復(fù)旦大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21