日韩成人黄色,透逼一级毛片,狠狠躁天天躁中文字幕,久久久久久亚洲精品不卡,在线看国产美女毛片2019,黄片www.www,一级黄色毛a视频直播

用于體內(nèi)合成LST-A的新型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的制作方法

文檔序號:39712774發(fā)布日期:2024-10-22 12:58閱讀:2來源:國知局
用于體內(nèi)合成LST-A的新型唾液酸轉(zhuǎn)移酶的制作方法

本公開涉及唾液酸化人乳寡糖(hmo)的生產(chǎn),特別是唾液酸-乳-n-四糖a(lst-a)的生產(chǎn),以及適合用于所述生產(chǎn)的遺傳工程細胞。


背景技術(shù):

1、設(shè)計和建造用于生產(chǎn)唾液酸化人乳寡糖(hmo),尤其是更復(fù)雜的唾液酸化人乳寡糖(hmo)的細菌細胞工廠,對于為未來更復(fù)雜的產(chǎn)品提供創(chuàng)新且可擴展的解決方案至關(guān)重要。

2、為此,合理的菌株工程原理通常應(yīng)用于單個細菌細胞。這些原理通常指a)向宿主引入所需的生物合成途徑,b)增加所需反應(yīng)中作為供體所需的相關(guān)活性糖的細胞池,c)通過天然乳糖通透酶lacy增強乳糖的輸入,和d)引入合適的糖基轉(zhuǎn)移酶以促進唾液酸化寡糖的生物合成生產(chǎn)(有關(guān)綜述,請參閱bych等人2019年,current?opinion?in?biotechnology56:130-137)。

3、例如,wo2007/101862公開了唾液酸化hmo的生產(chǎn),描述了從非致病性微生物中生產(chǎn)例如3’-sl所需的修飾,而無需向培養(yǎng)物提供唾液酸,從而以更便宜的方式大規(guī)模生產(chǎn)唾液酸化hmo。

4、wo2019/020707和wo2019/228993又描述了在遺傳修飾細胞中表達的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的實例,這些唾液酸轉(zhuǎn)移酶能夠產(chǎn)生唾液酸化hmo。然而,其中公開的唾液酸轉(zhuǎn)移酶僅產(chǎn)生少量或不產(chǎn)生復(fù)雜的唾液酸化hmo,并且顯示出高副產(chǎn)物形成。

5、唾液酸化hmo的生產(chǎn)可能會受到生產(chǎn)菌株中唾液酸轉(zhuǎn)移酶的副活性的阻礙,這可能會影響細胞在沒有底物的情況下茁壯生長的能力,這反過來又反映在唾液酸化hmo產(chǎn)物的產(chǎn)量較低上。

6、總之,唾液酸化hmo的生產(chǎn),尤其是更復(fù)雜的唾液酸化人乳寡糖(hmo)的生產(chǎn),通常受到所需唾液酸化hmo產(chǎn)量較低(與發(fā)酵后存在的其他hmo產(chǎn)物(例如hmo前體產(chǎn)物)相比)以及同時形成其他唾液酸化hmo種類(hmo副產(chǎn)物)的阻礙,這反過來又需要費力的分離程序。因此,需要對一種或多種特定唾液酸化hmo(特別是對一種或多種特定復(fù)雜唾液酸化hmo)更具特異性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶來降低副產(chǎn)物形成并簡化產(chǎn)物純化。


技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本公開涉及一種遺傳修飾細胞,其包含編碼具有α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的酶的重組核酸序列,所述酶能夠?qū)⑼僖核釓幕罨寝D(zhuǎn)移到lnt的末端半乳糖(受體)和/或乳糖的半乳糖(受體)。該遺傳修飾細胞能夠產(chǎn)生hmo,其中由細胞產(chǎn)生的總摩爾hmo含量的至少9%是lst-a。

2、具體而言,本公開涉及一種遺傳修飾細胞,其包含編碼選自ccol2、cjej1、csub1、chepa和clari1的酶的重組核酸序列,ccol2、cjej1、csub1、chepa和clari1的氨基酸序列分別與選自seq?id?no:1、2、3、4和5的氨基酸序列具有至少80%的同一性,并且其中所述細胞產(chǎn)生至少一種唾液酸化人乳寡糖(hmo)。唾液酸化hmo通常是lst-a和/或3’sl,這樣由細胞產(chǎn)生的總摩爾hmo含量的至少9%是lst-a。通常,產(chǎn)生的3’sl水平低于由所述細胞產(chǎn)生的hmo總摩爾含量的20%,例如低于10%。

3、根據(jù)本公開的遺傳修飾細胞可以進一步包括控制所述重組核酸表達的啟動子元件,所述重組核酸編碼具有α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的酶。唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以例如受選自具有分別選自seq?id?no?15-23和41至55的核酸序列的pglpf、plac、pmglb_70utr、pglpa_70utr和pglpt_70utr、及其變體的啟動子的控制。優(yōu)選地,編碼具有α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的酶的重組核酸受選自seq?id?no?15、20、21、22、23、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和52的強啟動子的控制。

4、根據(jù)本公開的遺傳修飾細胞還可以包含編碼能夠?qū)⑼僖核峄痟mo輸出到細胞外培養(yǎng)基中的mfs轉(zhuǎn)運蛋白的核酸序列。

5、根據(jù)本公開的遺傳修飾細胞還可以包含編碼至少一種糖基轉(zhuǎn)移酶的至少一種重組核酸序列,所述糖基轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)⑻腔鶜埢鶑奶腔w轉(zhuǎn)移到受體寡糖以產(chǎn)生唾液酸化人乳寡糖產(chǎn)物的前體,例如lnt,或者進一步修飾唾液酸化人乳寡糖以產(chǎn)生更復(fù)雜的唾液酸化人乳寡糖。

6、此外,根據(jù)本公開的遺傳修飾細胞通常包含編碼β-1,3-n-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶的重組核酸序列,例如來自腦膜炎奈瑟菌(neisseria?meningitidis)的lgta,和/或編碼β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的重組核酸序列,例如來自幽門螺桿菌(helicobacter?pylori)的galtk。

7、根據(jù)本公開的遺傳修飾細胞可以包含用于制造唾液酸糖核苷酸(例如cmp-neu5ac)的生物合成途徑。所述唾液酸糖核苷酸途徑可以由編碼來自空腸彎曲菌(campylobacter?jejuni)的neubca的核酸序列(seq?id?no:38)編碼。編碼neubca的核酸序列可以由帶有neubca操縱子的高拷貝質(zhì)粒編碼。

8、根據(jù)本公開的遺傳修飾細胞可以是微生物,例如細菌或真菌,其中所述真菌可以選自酵母細胞,例如komagataella屬、克魯維酵母屬(kluyveromyces)、耶氏酵母屬(yarrowia)、畢赤酵母屬(pichia)、saccaromyces屬、裂殖酵母屬(schizosaccharomyces)或漢遜酵母屬(hansenula)的酵母細胞,或選自aspargillus屬、鐮刀菌屬(fusarium)或thricoderma屬的絲狀真菌,并且所述細菌可以選自大腸桿菌屬(escherichia?sp.)、芽孢桿菌屬(bacillus?sp.)、乳酸桿菌屬(lactobacillus?sp.)和彎曲桿菌屬(campylobactersp.)。因此,根據(jù)本公開的遺傳修飾細胞可以是大腸桿菌。

9、根據(jù)本公開的遺傳修飾細胞可用于生產(chǎn)唾液酸化hmo。

10、因此,本公開還涉及生產(chǎn)唾液酸化人乳寡糖(hmo)的方法,所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)本公開的遺傳修飾細胞。

11、此外,本公開還涉及編碼具有α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的酶,例如選自ccol2、cjej1、csub1、chepa和clari1的酶的核酸構(gòu)建體,其中編碼該酶的序列優(yōu)選受啟動子序列的控制,例如選自pglpf、plac、pmglb_70utr、pglpa_70utr和pglpt_70utr、及其變體的啟動子(seq?id?no?15-23和seq?id?no:41-55)。所述核酸構(gòu)建體通常用于宿主細胞中以產(chǎn)生唾液酸化hmo,例如lst-a和/或3’sl。

12、下文將參考相關(guān)附圖和序列描述各種示例性實施方式和細節(jié)。應(yīng)注意的是,附圖僅旨在方便描述實施方式。它們并非旨在作為對本公開的詳盡描述或?qū)Ρ竟_范圍的限制。此外,所示實施方式不需要具有所示的所有方面或優(yōu)點。結(jié)合特定實施方式描述的方面或優(yōu)點不一定限于該實施方式,并且可以在任何其他實施方式中實施,即使沒有如此示出或沒有如此明確地描述。



技術(shù)特征:

1.一種遺傳修飾細胞,其包含編碼具有α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的酶的重組核酸序列,能夠產(chǎn)生由細胞產(chǎn)生的總摩爾hmo含量的至少9%的lst-a。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳修飾細胞,其中所述α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶選自:

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的遺傳修飾細胞,其中當乳糖用作hmo形成的初始底物時,所述細胞產(chǎn)生lst-a和3’sl。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的遺傳修飾細胞,其中產(chǎn)生的3’sl不超過由所述細胞產(chǎn)生的hmo的總摩爾含量的20%。

5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的遺傳修飾細胞,其中所述細胞還包含編碼β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的重組核酸序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的遺傳修飾細胞,其中所述遺傳修飾細胞還包含編碼β-1,3-n-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶的重組核酸序列。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6中任一項所述的遺傳修飾細胞,其中所述β-1,3-n-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶是來自腦膜炎奈瑟菌(neisseria?meningitidis)的lgta,并且所述β-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是來自幽門螺桿菌(helicobacter?pylori)的galtk。

8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的遺傳修飾細胞,其中所述細胞包含用于制造唾液酸糖核苷酸的生物合成途徑。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的遺傳修飾細胞,其中所述唾液酸糖核苷酸是cmp-neu5ac,且所述唾液酸糖核苷酸途徑由編碼來自空腸彎曲菌(campylobacter?jejuni)的neubca的核酸序列(seq?id?no:38)編碼。

10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的遺傳修飾細胞,其中所述遺傳修飾細胞是微生物,例如細菌或真菌。

11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的遺傳修飾細胞,其中所述細胞選自大腸桿菌(escherichia?coli)、枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、乳酸乳桿菌(lactobacilluslactis)、谷氨酸棒桿菌(corynebacterium?glutamicum)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、畢赤酵母(pichia?pastoris)和釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)。

12.根據(jù)權(quán)利要求10或11中任一項所述的遺傳修飾細胞,其中所述細胞是大腸桿菌。

13.一種產(chǎn)生唾液酸化人乳寡糖(hmo)的方法,所述方法包括培養(yǎng)包含編碼具有α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的酶的重組核酸序列的遺傳修飾細胞,其中所述酶選自:

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法,其中由所述方法產(chǎn)生的總摩爾hmo含量的至少9%是lst-a。

15.根據(jù)權(quán)利要求13或14中任一項所述的方法,其中所述遺傳修飾細胞是根據(jù)權(quán)利要求11至12中任一項所述的微生物。

16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項所述的方法,其中產(chǎn)生的所述唾液酸化人乳寡糖(hmo)是lst-a和3’sl。

17.根據(jù)權(quán)利要求13至16所述的方法,其中由所述細胞產(chǎn)生的3’sl含量低于由所述細胞產(chǎn)生的總hmo含量的20%。

18.根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一項所述的方法,其中所述方法包括在選自葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和甘油的能量來源的存在下培養(yǎng)所述遺傳工程細胞。

19.根據(jù)權(quán)利要求13至18中任一項所述的方法,其中在培養(yǎng)所述遺傳工程細胞期間加入乳糖作為hmo形成、特別是唾液酸化hmo形成的底物。

20.根據(jù)權(quán)利要求13至18中任一項所述的方法,其中在培養(yǎng)所述遺傳工程細胞期間供應(yīng)乳-n-三糖(lnt-ii)作為唾液酸化hmo形成的底物。

21.根據(jù)權(quán)利要求13至20中任一項所述的方法,其中所述唾液酸化人乳寡糖(hmo)從培養(yǎng)基和/或所述遺傳修飾細胞中回收。

22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法,其中l(wèi)st-a被純化以產(chǎn)生至少75%純的lst-a。

23.一種核酸構(gòu)建體,其包含編碼具有α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的酶的重組核酸序列,其中所述重組核酸序列選自:

24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的包含編碼具有α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的酶的重組核酸序列的核酸構(gòu)建體用于在宿主細胞中產(chǎn)生唾液酸化hmo的用途,其中通過該方法產(chǎn)生的總摩爾hmo含量的至少9%是lst-a。

25.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的遺傳修飾細胞用于產(chǎn)生唾液酸化hmo的用途。


技術(shù)總結(jié)
本公開涉及唾液酸化人乳寡糖(HMO)的生產(chǎn),特別是涉及從前體寡糖生產(chǎn)唾液酸?乳?N?四糖a(LST?a)和對用于所述生產(chǎn)的適宜細胞的遺傳工程,以及產(chǎn)生所述唾液酸化HMO的方法。

技術(shù)研發(fā)人員:M·帕帕扎基斯
受保護的技術(shù)使用者:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2024/10/21
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1