本發(fā)明涉及多發(fā)性骨髓瘤檢測(cè)，更具體地說(shuō)是涉及一組用于多發(fā)性骨髓瘤個(gè)體化診斷的m蛋白完整輕鏈標(biāo)志物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、多發(fā)性骨髓瘤(mm)是一種影響骨髓漿細(xì)胞的血癌，骨髓漿細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的單克隆免疫球蛋白(ig)，也稱為m蛋白。m蛋白對(duì)每個(gè)患者具有特異性，由重鏈(hc)(通常為igg或伊加同種型)和κ或λ輕鏈(lc)組成。惡性漿細(xì)胞有時(shí)僅過(guò)量產(chǎn)生免疫球蛋白的輕鏈組分，稱為游離輕鏈骨髓瘤。因此，正確監(jiān)測(cè)mm患者血清中的m蛋白對(duì)于確定疾病狀態(tài)和評(píng)估治療療效至關(guān)重要。血清蛋白電泳(spep)和免疫固定電泳(ife)是血清中m蛋白定量和表征的最常用檢測(cè)方法。然而，臨床常用的，如isatuximab，daratumumab等治療性抗體藥物可通過(guò)spep和ife檢測(cè)試劑盒檢出，尤其是在iggκ型m蛋白患者中，這可能混淆這些檢測(cè)試劑盒的判讀。由于mm的臨床應(yīng)答是基于m蛋白評(píng)估，因此臨床治療性抗體藥物對(duì)電泳試驗(yàn)的干擾可能給予可檢出的假陽(yáng)性m蛋白，可能導(dǎo)致患者治療應(yīng)答測(cè)定不準(zhǔn)確。

2、用于m蛋白鑒定的基于免疫富集偶聯(lián)質(zhì)譜法的方法可提供血清pel和ife的高通量替代方法。最初的方法是基于lc-esi-q-tof-ms，并顯示出比基于凝膠的技術(shù)提供更高的分析靈敏度和特異性。隨后，由于需要更高通量的方法用于常規(guī)臨床分析，因此開發(fā)了另外2種方法：mass-screen和mass-fix(這兩種方法都涉及通過(guò)maldi-tof?ms進(jìn)行還原的總免疫球蛋白免疫富集和總輕鏈(tlc)質(zhì)量測(cè)量，可以目視檢查所得tlc質(zhì)譜的與m蛋白的存在一致的特征，即在獨(dú)特的質(zhì)荷比(m/z)處的相對(duì)較高強(qiáng)度峰。到目前為止，已證明這些方法具有與ife相當(dāng)?shù)姆治鲮`敏度和與目前推薦的m蛋白篩查試劑盒(pel?eife?erflc)相當(dāng)?shù)呐R床靈敏度。

3、質(zhì)譜技術(shù)基于每個(gè)免疫球蛋白具有獨(dú)特的氨基酸序列并因此具有獨(dú)特的質(zhì)量的原理。這種患者特異性質(zhì)量隨時(shí)間推移而穩(wěn)定，可用作疾病生物標(biāo)志物。運(yùn)用質(zhì)譜法檢測(cè)m蛋白的方法主要有高效液相色譜與電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(hplc-esi-ms)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(maldi-tof)兩種。目前已經(jīng)發(fā)表了兩種基于hplc-esi-ms的方法。第一種方法，基于lc-esi-ms/ms(串聯(lián)質(zhì)譜法)測(cè)量來(lái)自ig互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的克隆型肽作為m蛋白的替代標(biāo)記物。該方法需要首先獲得患者本人的m蛋白氨基酸序列，使得分析更加復(fù)雜和昂貴?；颊咛禺愋怨ぷ髁鞒淌窃摲椒ǖ闹饕秉c(diǎn)，其需要預(yù)先進(jìn)行樣品分析以從患者的m蛋白cdr中鑒定獨(dú)特的肽，而后需要基于使用特定多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)轉(zhuǎn)換對(duì)獨(dú)特肽的分析來(lái)開發(fā)患者特異性方法。此外，在某些情況下，克隆型肽可能產(chǎn)生不足的信號(hào)強(qiáng)度，使得該方法無(wú)效。第二種方法稱為“單克隆免疫球蛋白快速精確分子質(zhì)量(miramm)"，是一種基于ig輕鏈(lc)單一同位素質(zhì)量的非靶向測(cè)量。在某些患者中，m蛋白僅以游離輕鏈單克隆蛋白的形式存在。miramm的工作流程比克隆型肽方法更簡(jiǎn)單，特別是在樣品制備和數(shù)據(jù)分析階段。此外，由于工作流程不是m蛋白特異性的，因此其更適合于具有大量患者人群的臨床研究。盡管明確測(cè)定m蛋白lc質(zhì)量需要診斷樣本(具有高m蛋白濃度的血清樣本)，但非靶向分析能夠檢測(cè)其他單克隆抗體，例如治療性抗體或來(lái)自多克隆背景的內(nèi)源性ig。此外，這種非靶向方法能夠檢測(cè)翻譯后修飾，例如糖基化，在一些患者的m蛋白中觀察到。然而，與克隆型肽方法相比，ig多克隆背景對(duì)ms信號(hào)的影響更大，這可能降低靈敏度，這是miramm方法的缺點(diǎn)。

4、maldi-tof?ms在常規(guī)篩查和m蛋白監(jiān)測(cè)中非常有意義，因其較spep和ife的檢測(cè)限更優(yōu)，較lc-esi-ms數(shù)據(jù)收集更快(每個(gè)樣品不到1分鐘)，成本更低。maldi-tof?ms的臨床效用已在先前的研究中進(jìn)行了評(píng)價(jià)。然而，臨床上尚未開發(fā)使用maldi-tof?ms檢測(cè)血液中m蛋白完整輕鏈(intact-mprotein?light?chain，imlc)的精確分子量實(shí)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者的精準(zhǔn)個(gè)體化定性分類的方法，也未從真實(shí)世界中發(fā)現(xiàn)用于診斷的多發(fā)性骨髓瘤疾病診斷標(biāo)志物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明實(shí)施例一方面在于提供一種用于檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤的特定質(zhì)荷比的m蛋白輕鏈，包括如下任意一個(gè)或任意多個(gè)組合的分子量的m蛋白完整輕鏈：m/z，[m+h]+為22841.236、21097.850、22880.621、23769.722、23785.734、23770.710、22309.569、23404.634、23686.234、24409.956；或[m+2h]2+為11421.122、10549.429、11440.8145、11885.365、11893.371、11885.859、11155.289、11702.821、11843.621、12205.482。

4、本發(fā)明實(shí)施例第二方面在于提供特定質(zhì)荷比的m蛋白輕鏈在制備檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒中的應(yīng)用，所述特定質(zhì)荷比的m蛋白輕鏈為權(quán)利要求1所述的m蛋白輕鏈。

5、本發(fā)明實(shí)施例第三方面在于提供一種檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒，包括檢測(cè)所述的m蛋白輕鏈的物質(zhì)。

6、本發(fā)明實(shí)施例第四方面在于提供一種分離所述的m蛋白輕鏈的方法，過(guò)程包括：

7、s1：通過(guò)免疫親和微球初步捕獲血漿中的m蛋白完整輕鏈；

8、s2：通過(guò)10mm?pbs和純水清洗并去除雜質(zhì)，以純化s1獲得的m蛋白完整輕鏈；

9、s3：對(duì)s2獲得的m蛋白完整輕鏈采用50mm?tecp溶液進(jìn)行m蛋白完整輕鏈的釋放；

10、s3：通過(guò)maldi-tof質(zhì)譜鑒定s3中釋放的富集的m蛋白完整輕鏈，得到該患者獨(dú)有的m蛋白完整輕鏈的分子量，并采用高分辨質(zhì)譜esi-obitrap進(jìn)行精確分子量校正。

11、本發(fā)明根據(jù)不同m蛋白的分子量實(shí)現(xiàn)對(duì)不同多發(fā)性骨髓瘤患者的精準(zhǔn)個(gè)體化定性分類，避免目前臨床m蛋白檢測(cè)方法中治療性抗體藥物對(duì)m蛋白檢測(cè)的干擾。

技術(shù)特征：

1.一組用于多發(fā)性骨髓瘤個(gè)體化診斷的m蛋白完整輕鏈標(biāo)志物，其特征在于，所述m蛋白輕鏈包括如下任意一個(gè)或任意多個(gè)組合的分子量的m蛋白完整輕鏈：m/z，[m+h]+為22841.236、21097.850、22880.621、23769.722、23785.734、23770.710、22309.569、23404.634、23686.234、24409.956；或[m+2h]2+為11421.122、10549.429、11440.8145、11885.365、11893.371、11885.859、11155.289、11702.821、11843.621、12205.482。

2.特定質(zhì)荷比的m蛋白輕鏈在制備檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述特定質(zhì)荷比的m蛋白輕鏈為權(quán)利要求1所述的m蛋白輕鏈。

3.一種檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒，其特征在于，包括檢測(cè)權(quán)利要求1所述的m蛋白輕鏈的物質(zhì)。

4.一種分離權(quán)利要求1所述的m蛋白輕鏈的方法，其特征在于，過(guò)程包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一組用于多發(fā)性骨髓瘤個(gè)體化診斷的M蛋白完整輕鏈標(biāo)志物及其應(yīng)用，涉及多發(fā)性骨髓瘤檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明利用Capture?Select?Kappa?XL和Capture?Select?LC?Lambda?Affinity?Matrix獲得血漿中的M蛋白完整輕鏈(Intact?M?protein?light?chain，IMLC)，經(jīng)過(guò)PBS清洗去除其他成分后，再用純水洗去PBS，最后用50mM?Tris(2?carboxyethyl)phosphine(TE?CP，1％甲酸配制)洗脫，最終得到IMLC。首先采用MALDI?TOF?MS檢測(cè)IMLC的準(zhǔn)確分子量(m/z)，然后采用ESI?MS進(jìn)一步確定IMLC的精確分子量，依據(jù)不同的IMLC分子量對(duì)多發(fā)性骨髓瘤患者進(jìn)行個(gè)體化診斷。

技術(shù)研發(fā)人員：董玉君,李智立,賴治臻,唐博,劉繪繪,解偉偉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京大學(xué)第一醫(yī)院（北京大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/9