本發(fā)明涉及分離純化，具體涉及一種分離純化磷脂型dha的柱層析法。

背景技術(shù)：

1、磷脂型dha(phospholipids-docosahexaenoic?acid，pls-dha)以磷脂構(gòu)型存在的二十二碳六烯酸(docosahexaenoic?acid，dha)，同時兼具了磷脂與dha的雙重優(yōu)勢。dha的主要存在型式有四種，分別是磷脂型dha、甘油三酯型dha(triglycerides-docosahexaenoic?acid，tag-dha)、乙酯型dha(ethyl?esters-docosahexaenoic?acid，ee-dha)、游離型dha(free?fatty?acids-docosahexaenoic,ffa-dha)。磷脂型dha相較于其它類型的dha更容易被多種器官細胞吸收，能夠進行抗炎、免疫等作用。根據(jù)現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)磷脂型dha對于母嬰健康有重要作用，對于嬰兒的智力也發(fā)揮一定作用；具有免疫、抗炎的作用，對于腸道菌群失調(diào)的改善以及腦內(nèi)損傷患者的修復、治愈有良好的作用；磷脂型dha具有更高的營養(yǎng)價值，在體內(nèi)的運輸方式是主動運輸，更有利于人體的吸收；其天然存在于海洋磷蝦、魚類等海洋生物中，但是天然的磷脂型dha的量有限，因此尋求人工合成的方法制備磷脂型dha。微生物發(fā)酵、化學合成、酶催化合成等人工合成的方法被人們所關(guān)注，其中酶催化合成法具有更高的反應效率、條件溫和、綠色環(huán)保等優(yōu)勢，而得到了關(guān)注。但其得到的磷脂型dha的純度有限。

2、目前國內(nèi)外有關(guān)磷脂型dha的分離純化的方法主要有：溶劑處理法、薄層層析法、超臨界流體萃取法。溶劑處理法是利用有機溶劑與磷脂型dha的極性的原理萃取磷脂型dha，磷脂能夠溶于正己烷、氯仿等低極性溶劑中，而幾乎不溶于丙酮。但是溶劑處理法中得到的磷脂純度不高，得到的丙酮不溶物中還是會有少量油脂附著在磷脂型dha表面。薄層層析法(tlc)是通過樣品中各個組分與吸附劑的作用力的大小不同，在展開劑中的比移值rf不同，從而實現(xiàn)將各個組分分離。tlc法能實現(xiàn)不同磷脂組分的分離分析，具有方便快捷、直觀靈敏等優(yōu)點，但由于上樣量較少，主要適用于實驗室中進行低上樣量級的分離分析實驗。超臨界流體萃取法利用物質(zhì)各組分在超臨界流體中溶解度的不同實現(xiàn)各組分的分離。超臨界流體萃取法對于設備要求較高，生產(chǎn)成本大。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明提供一種分離純化磷脂型dha的柱層析法，該方法能夠得到收率較高、dha提取率較高的磷脂型dha，能夠為未來工業(yè)化生產(chǎn)高純磷脂型dha提供技術(shù)支持。

2、本發(fā)明提出了一種分離純化磷脂型dha的柱層析法，其包括：

3、以由磷脂酰膽堿pc和藻油dha經(jīng)固定化脂肪酶b催化合成的產(chǎn)物磷脂為進樣原料，以硅膠作為固定相，使用氯仿：甲醇的混合溶液作為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫有磷脂酰膽堿和副產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿的級分，去除溶劑后，得到磷脂型dha。

4、根據(jù)本發(fā)明的一種分離純化磷脂型dha的柱層析法，該方法在硅膠柱層析中使用的流動相采用氯仿/甲醇體系，分離效果好，工藝簡單，得到的pc純度為98.85％，pc收率為88.89％，pc中dha含量為25.20％，磷脂型dha的提取率為71.77％，能夠為以后工業(yè)化分離純化高純度的磷脂型dha奠定基礎。

5、可選地，在色譜柱填料為25g硅膠、硅膠目數(shù)為300-400目、上樣量為0.3g-2g、洗脫液為氯仿：甲醇＝1:2-1:5、上樣濃度為50mg/ml-150mg/ml的條件下進行硅膠柱色譜純化。

6、進一步，在色譜柱填料為25g硅膠、硅膠目數(shù)為300-400目、上樣量為0.6g、洗脫液為氯仿：甲醇＝1:4、上樣濃度為100mg/ml的條件下進行硅膠柱色譜純化。

7、可選地，收集洗脫有磷脂酰膽堿和副產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿的級分為收集前60ml-195ml洗脫液。

8、可選地，所述進料原料中dha的含量為31.2％，pc的含量為74.79％。

9、可選地，將磷脂酰膽堿pc與藻油dha按照質(zhì)量比1:8加入到三角瓶中，并添加正己烷，加入固定化脂肪酶b和分子篩，充入n2后，50℃、200rpm的條件下反應72h，得到反應產(chǎn)物；

10、通過抽濾將所述反應產(chǎn)物中的分子篩和固定化脂肪酶去除，收集濾液后50℃下旋蒸脫溶，加入4倍體積的冷丙酮，得到丙酮不溶物，在4℃、6000rpm條件下離心10min，傾倒上層液體，用n2吹干殘存丙酮，得到所述進料原料。

11、進一步，所述磷脂酰膽堿與所述正己烷的比例為1:50m/v；所述固定化脂肪酶b的加入量為25％的總底物質(zhì)量；所述所述磷脂酰膽堿與所述正己烷的比例為0.02g/ml。

12、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

技術(shù)特征：

1.一種分離純化磷脂型dha的柱層析法，其特征在于，包括：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在色譜柱填料為25g硅膠、硅膠目數(shù)為300-400目、上樣量為0.3g-2g、洗脫液為氯仿：甲醇＝1:2-1:5、上樣濃度為50mg/ml-150mg/ml的條件下進行硅膠柱色譜純化。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在色譜柱填料為25g硅膠、硅膠目數(shù)為300-400目、上樣量為0.6g、洗脫液為氯仿：甲醇＝1:4、上樣濃度為100mg/ml的條件下進行硅膠柱色譜純化。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，收集洗脫有磷脂酰膽堿和副產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿的級分為收集前60ml-195ml洗脫液。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述進料原料中dha的含量為31.2％，pc的含量為74.79％。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將磷脂酰膽堿pc與藻油dha按照質(zhì)量比1:8加入到三角瓶中，并添加正己烷，加入固定化脂肪酶b和分子篩，充入n2后，50℃、200rpm的條件下反應72h，得到反應產(chǎn)物；

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述磷脂酰膽堿與所述正己烷的比例為1:50m/v；所述固定化脂肪酶b的加入量為25％的總底物質(zhì)量；所述所述磷脂酰膽堿與所述正己烷的比例為0.02g/ml。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種分離純化磷脂型DHA的柱層析法，包括：以由磷脂酰膽堿PC和藻油DHA經(jīng)固定化脂肪酶B催化合成的產(chǎn)物磷脂為進樣原料，以硅膠作為固定相，使用氯仿：甲醇的混合溶液作為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫有磷脂酰膽堿和副產(chǎn)物溶血磷脂酰膽堿的級分，去除溶劑后，得到磷脂型DHA。該方法能夠得到收率較高、DHA提取率較高的磷脂型DHA，能夠為未來工業(yè)化生產(chǎn)高純磷脂型DHA提供技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：凌雪萍,張雨欣,盧英華,齊書華
受保護的技術(shù)使用者：廈門大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21