本發(fā)明屬于特立帕肽改性，具體涉及一種聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、這里的陳述僅提供與本發(fā)明相關(guān)的背景技術(shù)，而不必然地構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。

2、隨著人口老齡化，骨質(zhì)疏松正逐漸成為全球常見(jiàn)疾病之一。骨質(zhì)疏松會(huì)使患者骨骼強(qiáng)度降低，增大患者骨折的風(fēng)險(xiǎn)。骨質(zhì)疏松性骨折和骨脆性的增加嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，給患者和社會(huì)都帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在50歲以上的髖部骨折患者中，每年約有20％的患者會(huì)死亡，50％的患者會(huì)出現(xiàn)殘疾。這表明進(jìn)行有效的骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療對(duì)于預(yù)防骨折至關(guān)重要。根據(jù)其作用機(jī)制，骨質(zhì)疏松治療藥物可分為骨吸收抑制劑和骨形成促進(jìn)劑。目前臨床上使用的骨吸收抑制劑主要包括選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素、雌激素、雙磷酸鹽和rankl抑制劑，骨形成促進(jìn)劑主要包括甲狀旁腺激素類(lèi)似物(特立帕肽和阿巴帕肽)。一些研究表明，特立帕肽能夠改善骨密度和骨的生物力學(xué)特性，并加速骨折愈合。

3、特立帕肽是人甲狀旁腺激素n端活性片段，由34個(gè)氨基酸組成，一般簡(jiǎn)稱(chēng)pth(1-34)，其皮下注射的半衰期為1h，目前已在世界范圍內(nèi)被批準(zhǔn)用于治療男性骨質(zhì)疏松以及女性絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松。但pth(1-34)存在體內(nèi)代謝較快，半衰期較短的問(wèn)題，需要每日注射給藥，給患者帶來(lái)極大不便。

4、peg是一種具有末端羥基的直鏈或支鏈聚合物，其結(jié)構(gòu)式為ho-(ch2ch2o)n-ch2ch2-oh。單甲氧基peg因具有單一的反應(yīng)基團(tuán)，而常用于蛋白質(zhì)和多肽的修飾，其結(jié)構(gòu)式為ch3o-(ch2ch2o)n-ch2ch2-oh。peg是一種中性的兩親性聚合物，可以溶于水相和有機(jī)相中，它的每個(gè)單體可以結(jié)合2-3分子的水，所以peg的流體力學(xué)半徑比相同分子量的球狀蛋白要高5-10倍。單甲氧基peg常被進(jìn)一步功能化，用于多肽和蛋白質(zhì)的peg修飾。peg修飾可能會(huì)占據(jù)蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)或受體結(jié)合位點(diǎn)，也可能使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。這促使研究人員尋找定點(diǎn)peg化技術(shù)并生產(chǎn)出單peg化產(chǎn)品，定點(diǎn)peg修飾是將peg引入不同蛋白質(zhì)或多肽特定氨基酸位點(diǎn)的一種有效策略，目前已有在特立帕肽末端引入半胱氨酸等修飾策略對(duì)其進(jìn)行聚乙二醇化修飾，但是在多肽與聚乙二醇反應(yīng)時(shí)，所用的反應(yīng)條件會(huì)使特立帕肽的活性受到影響。

5、銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成(cuaac)能夠形成1,4-二取代的三唑，反應(yīng)速率較快，目前已在有機(jī)合成、聚合物功能化、藥物發(fā)現(xiàn)和化學(xué)生物學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，但是，cuaac在生物偶聯(lián)中的應(yīng)用仍有一些局限性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽及其制備方法和應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)如下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽，聚乙二醇修飾于特立帕肽的13位、26位或27位中的至少一個(gè)位點(diǎn)；

4、聚乙二醇的修飾結(jié)構(gòu)如下所示：

5、

6、第二方面，本發(fā)明提供所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽的制備方法，包括如下步驟：

7、將4-二苯并環(huán)辛醇dibo和甲氧基聚乙二醇發(fā)生親核取代反應(yīng)，制備dibo-mpeg；

8、特立帕肽衍生物與dibo-mpeg通過(guò)生物正交反應(yīng)，制備聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽；

9、特立帕肽衍生物中發(fā)生生物正交反應(yīng)的氨基酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)為：

10、該側(cè)鏈位于特立帕肽的13位、26位或27位中的至少一個(gè)位點(diǎn)上。

11、4-二苯并環(huán)辛醇(dibo)的衍生物具有與含有疊氮基的糖和氨基酸反應(yīng)迅速的特點(diǎn)，可用于可視化活細(xì)胞的代謝標(biāo)記。因此，通過(guò)spaac反應(yīng)對(duì)pth(1-34)進(jìn)行peg定點(diǎn)修飾，可以有效解決pth(1-34)半衰期較短的問(wèn)題。

12、在一些實(shí)施例中，dibo和甲氧基聚乙二醇親核取代的催化劑為三乙胺，溶劑為二氯甲烷。

13、優(yōu)選的，親核取代的溫度為20-30℃，親核取代的時(shí)間為10-15h。

14、在一些實(shí)施例中，生物正交反應(yīng)的溫度為1-5℃，反應(yīng)時(shí)間為2-6h。

15、優(yōu)選的，生物正交反應(yīng)的溫度為3-5℃，反應(yīng)時(shí)間為3-5h。

16、進(jìn)一步優(yōu)選的，特立帕肽衍生物與dibo-mpeg的摩爾比為1:0.8-1.2，優(yōu)選為1:1。

17、在一些實(shí)施例中，聚乙二醇的分子量為10-20kda。

18、在一些實(shí)施例中，還包括將制備的聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽進(jìn)行分離純化的步驟。

19、優(yōu)選的，所述分離純化的方法為離子交換層析或凝膠過(guò)濾層析。

20、第三方面，本發(fā)明提供所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

21、上述本發(fā)明的一種或多種實(shí)施例取得的有益效果如下：

22、本發(fā)明的聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽在大鼠體內(nèi)的半衰期得到了顯著延長(zhǎng)，是特立帕肽的5倍，能夠減少患者的給藥頻率。

23、本發(fā)明的聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽在相同給藥劑量下，治療骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)作用優(yōu)于特立帕肽。

技術(shù)特征：

1.一種聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽，其特征在于：聚乙二醇修飾于特立帕肽的13位、26位或27位中的至少一個(gè)位點(diǎn)；

2.權(quán)利要求1所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽的制備方法，其特征在于：dibo和甲氧基聚乙二醇親核取代的催化劑為三乙胺，溶劑為二氯甲烷。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽的制備方法，其特征在于：親核取代的溫度為20-30℃，親核取代的時(shí)間為10-15h。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽的制備方法，其特征在于：生物正交反應(yīng)的溫度為1-5℃，反應(yīng)時(shí)間為2-6h；

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽的制備方法，其特征在于：特立帕肽衍生物與dibo-mpeg的摩爾比為1:0.8-1.2。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽的制備方法，其特征在于：聚乙二醇的分子量為10-20kda。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽的制備方法，其特征在于：還包括將制備的聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽進(jìn)行分離純化的步驟。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽的制備方法，其特征在于：所述分離純化的方法為離子交換層析或凝膠過(guò)濾層析。

10.權(quán)利要求1所述聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽，或權(quán)利要求2-9任一所述制備方法制備得到的聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽在制備治療骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽及其制備方法和應(yīng)用，聚乙二醇修飾于特立帕肽的13位、26位或27位中的至少一個(gè)位點(diǎn)；聚乙二醇的修飾結(jié)構(gòu)如下所示：本發(fā)明的聚乙二醇定點(diǎn)修飾的特立帕肽在大鼠體內(nèi)的半衰期得到了顯著延長(zhǎng)，是特立帕肽的5倍，能夠減少患者的給藥頻率；在相同給藥劑量下，治療骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)作用優(yōu)于特立帕肽。

技術(shù)研發(fā)人員：婁紅祥,劉甜甜,李媛,徐澤軍,孫斌,胡富浩
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21