本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種廣譜性抗菌肽及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、抗菌肽(amps)又稱(chēng)宿主防御肽，通常是由7～100個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，廣泛存在于自然界的各種生物中，是生物體天然免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。研究顯示，抗菌肽具有多種生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)和抗腫瘤活性等，相比傳統(tǒng)抗生素具有較低的耐藥發(fā)生率，被認(rèn)為是解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題的最佳選擇。

2、抗菌肽作為當(dāng)前抗菌和抗病毒藥物開(kāi)發(fā)的重要對(duì)象，存在以下問(wèn)題：

3、(1)安全性有限。多數(shù)抗菌肽通過(guò)破壞細(xì)胞膜殺滅微生物，由于膜成分相似，同時(shí)也可能破壞人體內(nèi)的正常細(xì)胞，濃度高時(shí)出現(xiàn)溶血效應(yīng)。

4、(2)設(shè)計(jì)改造難。為使抗菌肽同時(shí)具有抑菌效果好、溶血作用低等性質(zhì)，研究者通常采用氨基酸殘基替換、化學(xué)修飾、抗菌肽組合等方式人工設(shè)計(jì)改造天然抗菌肽。此類(lèi)設(shè)計(jì)方法過(guò)于依賴(lài)于研究者對(duì)多肽性質(zhì)的充足先驗(yàn)知識(shí)，過(guò)程繁瑣，成功率低。此類(lèi)方法中可供改造的多肽序列范圍也受限于已有的amp序列庫(kù)，不能直接生成全新的amp序列。

5、隨著人工智能的興起，深度學(xué)習(xí)模型可以快速學(xué)習(xí)大量已知藥物的樣本，完成訓(xùn)練的生成模型可直接采樣生產(chǎn)全新的藥物分子，判別模型可通過(guò)預(yù)測(cè)這些分子的屬性篩選識(shí)別出新的潛在成藥對(duì)象，有效加快藥物設(shè)計(jì)進(jìn)程。專(zhuān)利cn117343148a公開(kāi)了一種通過(guò)人工智能生成模型直接生成的抗菌肽，該抗菌肽具有較低的細(xì)胞毒性和溶血活性，但是可抑制的細(xì)菌種類(lèi)有限，在廣譜抗菌方面有一定的限制性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在利用深度學(xué)習(xí)模型提供一種兼具蜂毒肽廣譜抗菌活性和使用安全性的抗菌肽。

2、為達(dá)此目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種廣譜性抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列為gecegnnrpvkkpqprkklprfkkc-nh2。

4、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述抗菌肽抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌。

5、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、綠膿桿菌，所述革蘭氏陽(yáng)性菌包括金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌，所述真菌包括白色念珠菌。

6、第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種廣譜性抗菌肽在化妝品、口腔護(hù)理產(chǎn)品中的應(yīng)用。

7、第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種廣譜性抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：

8、s1：基于蜂毒肽ia的氨基酸序列g(shù)nnrpvyipqprpphpri-nh2，預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)得到所述抗菌肽的氨基酸序列；

9、s2：將預(yù)測(cè)的抗菌肽進(jìn)行基因合成，并插入在質(zhì)粒中構(gòu)建重組質(zhì)粒；

10、s3：將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，在含40-60μg/ml?amp的lb平板中涂布并過(guò)夜培養(yǎng)，選取優(yōu)質(zhì)菌落進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，獲得重組菌；

11、s4：將重組菌活化，誘導(dǎo)表達(dá)，分離純化，收集得到抗菌肽。

12、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟s1中采用深度學(xué)習(xí)模型抗菌肽預(yù)測(cè)工具ampeppy設(shè)計(jì)抗菌肽。

13、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，對(duì)所述步驟s2中預(yù)測(cè)的抗菌肽進(jìn)行基因合成，合成堿基序列為：

14、aaggccatggggtgaatgcgaaggtaacaatcgtccggttaaaaaacca?caaccgcgtaaaaaactgccacgtttcaagaaatgctaaaagcttgcgg。

15、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟s2的具體步驟為：將抗菌肽進(jìn)行基因合成，插入在質(zhì)粒pet32a(+)中ncoⅰ與hindⅲ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒，如附圖1所示，即pet32a(+)-(ia-1)重組質(zhì)粒。

16、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟s3的具體步驟為：將重組質(zhì)粒pet32a(+)-(ia-1)導(dǎo)入大腸桿菌bl21(de3)，在含有40-60μg/ml?amp(氨芐西林)的lb培養(yǎng)基平板中35-38℃過(guò)夜培養(yǎng)，各平板分別挑選3個(gè)優(yōu)質(zhì)菌落進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，最終獲得重組菌。

17、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，步驟s4誘導(dǎo)表達(dá)的具體步驟為：

18、m1：將重組菌活化，挑取單菌落接種于含40-60μg/ml?amp的lb液體培養(yǎng)基中，35-38℃振蕩培養(yǎng)6-8h，然后按照菌液：培養(yǎng)基體積比1：(80～120)的比例將菌液轉(zhuǎn)接于新鮮的含40-60μg/ml?amp的lb液體培養(yǎng)基中，35-38℃振蕩培養(yǎng)至od600為0.6～0.8，加入終濃度為0.3-0.7mm的iptg，在16～25℃下過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)12-48h；

19、m2：誘導(dǎo)表達(dá)后，室溫下將菌體離心，收集菌體沉淀，按照菌體沉淀：裂解液體積比1:(15～30)的比例，往菌體沉淀中加入裂解液，并在冰浴條件下對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，破碎完成后離心，收集上清液。

20、優(yōu)選地，所述裂解液組成包括20mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mm?nacl，ph為7.2-7.5。

21、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟s4分離純化的具體步驟為：

22、h1：將步驟m2中收集的上清液用0.2-0.8μm濾膜過(guò)濾，得濾液；

23、h2：在冰水浴下，將濾液與ni樹(shù)脂按照1：(0.3～1.5)的體積比攪拌混合40-60min，然后將ni樹(shù)脂裝入層析柱，先用緩沖液a洗去雜蛋白，再用緩沖液b洗脫，收集洗脫液；

24、h3：向洗脫液中加入終酶活為0.08-0.15u的腸激酶，先在14-18℃下反應(yīng)10-14h，再在50-70℃條件下反應(yīng)20-40min，最后在10000-14000rpm下離心10-20min，收集上清液；

25、h4：將上清液置于截留分子量為1kda的超濾離心管中，在3000-5000rpm下離心10-20min；按照截流液：pbs溶液體積比為1:(10～30)的比例，用10-30mm的pbs溶液洗滌截流液，并在3000-5000rpm下離心，重復(fù)三次，收集截流液，即為抗菌肽溶液。

26、優(yōu)選地，所述緩沖液a包含100mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mm?nacl；所述緩沖液b包含500mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mm?nacl。

27、第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種如第一和第二方面所述的廣譜性抗菌肽在化妝品、口腔護(hù)理產(chǎn)品中的應(yīng)用。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

29、(1)本發(fā)明提供的抗菌肽具有廣譜抗菌活性、熱穩(wěn)定性和低溶血性；對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、痤瘡丙酸桿菌均具有很好的抑制效果。

30、(2)本發(fā)明提供的廣譜性抗菌肽利用深度學(xué)習(xí)模型篩選預(yù)測(cè)概率＞95％的抗菌肽進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用生物工程技術(shù)制備得到，具有篩選工作量小，篩選周期短、篩選效率高的特點(diǎn)。

技術(shù)特征：

1.一種廣譜性抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列為gecegnnrpvkkpqprkklprfkkc-nh2。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述廣譜性抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述廣譜性抗菌肽，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌、綠膿桿菌，所述革蘭氏陽(yáng)性菌包括金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌，所述真菌包括白色念珠菌。

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述廣譜性抗菌肽在化妝品、口腔護(hù)理產(chǎn)品中的應(yīng)用。

5.一種根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述步驟s1中采用深度學(xué)習(xí)模型抗菌肽預(yù)測(cè)工具ampeppy設(shè)計(jì)抗菌肽，所述步驟s2中合成的基因插入在質(zhì)粒pet32a(+)的ncoⅰ與hindⅲ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述步驟s4誘導(dǎo)表達(dá)的具體步驟為：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述裂解液a的組成包含20mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mm?nacl，ph為7.2-7.5。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述步驟s4分離純化的步驟為：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述廣譜性抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述緩沖液a包含100mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mm?nacl；所述緩沖液b包含500mm咪唑，20mm?tris-hcl，20mmnacl。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種廣譜性抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列為GECEGNNRPVKKPQPRKKLPRFKKC?NH2。本發(fā)明以蜂毒肽為基礎(chǔ)，基于深度學(xué)習(xí)模型預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)抗菌肽，得到廣譜抑菌、熱穩(wěn)定、低溶血性的抗菌肽，對(duì)皮膚致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、痤瘡丙酸桿菌具有較好的抑制效果。選擇深度學(xué)習(xí)模型抗菌肽預(yù)測(cè)工具amPEPpy預(yù)測(cè)為AMP氨基酸序列的肽進(jìn)行篩選，采用生物合成技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)、提取純化，減少了篩選的工作量和篩選周期，提高了篩選出廣譜、熱穩(wěn)定的生物合成抗菌肽的概率。

技術(shù)研發(fā)人員：韋朝寶,湯杰,賀鳳,薛永永,張啟清,曾颯,倪軍,蔣震,馮海燕
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州棟方生物科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21