本發(fā)明涉及基因檢測，具體為一種適用于動植物組織粗提模板擴(kuò)增的pcr試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著基因編輯技術(shù)并以crispr/cas9系統(tǒng)為代表，對基因進(jìn)行靶向敲除、插入、替換等而獲得新的生物特征和功能的技術(shù)，在諸多生物領(lǐng)域中得到飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。利用這種技術(shù)手段研究基因突變動植物已在生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)環(huán)保等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并成為研究人類各種各樣疾病(如生殖、腫瘤、代謝、罕見病等)重要手段，也是提高糧食產(chǎn)量、增加植物耐受性(抗旱、抗蟲、耐藥等)等植物領(lǐng)域的重要手段。對轉(zhuǎn)基因動物和植物進(jìn)行基因敲除、插入等數(shù)量日趨增多，已成為各實(shí)驗(yàn)室對動植物基因鑒定的重要和枯燥的常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作。

2、小鼠、水稻、玉米等基因分型鑒定前面臨大量的dna提取，而對于傳統(tǒng)的dna提取方法如酚氯仿異戊醇、ctab等，雖然其能得到純度較高的gdna模板，但繁瑣而復(fù)雜實(shí)驗(yàn)操作流程(如反復(fù)的離心和洗滌、rna去除等)使dna提取耗時耗力、污染環(huán)境。

3、這個問題的解決需要從改進(jìn)pcr擴(kuò)增技術(shù)入手，開發(fā)出更高效、簡便、靈敏度高抗抑制的直接擴(kuò)增pcr試劑，使基因型鑒定簡單化和準(zhǔn)確性。

4、目前，人們研發(fā)出這樣的新型簡單化的dna裂解技術(shù)，但需要有與之對應(yīng)的擴(kuò)增抗抑制pcr擴(kuò)增mix，可以在動植物組織樣品裂解后直接進(jìn)行擴(kuò)增，無需額外的dna提取步驟，大大簡化操作流程。該pcr?mix應(yīng)具備以下條件：1、該pcr?mix應(yīng)具有很強(qiáng)的抗抑制能力，可以很好地?cái)U(kuò)增從生物樣品直接裂解的dna，不受樣品成分影響；2、pcr?mix的靈敏度應(yīng)能達(dá)到僅需幾個細(xì)胞或者幾納克dna就可以獲得理想產(chǎn)物的水平，從而最大限度減少dna輸入量；3、考慮到不同樣品的特點(diǎn),可開發(fā)通用型和特定樣品優(yōu)化的pcr?mix系列產(chǎn)品；4、長期研發(fā)可實(shí)現(xiàn)pcr?mix的微小化和低成本,更適用于資源有限的場。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、(一)解決的技術(shù)問題

2、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種適用于動植物組織粗提模板擴(kuò)增的pcr試劑盒及其應(yīng)用。

3、(二)技術(shù)方案

4、一種適用于動植物組織粗提模板擴(kuò)增的pcr試劑盒由1x?lysis?buffer、20mg/ml的蛋白酶k、2x?direct?pcr?mix組成。

5、優(yōu)選的，所述pcr試劑盒包含如下組分：

6、10-50mm?tris-hcl(ph?9.0)、20-40mm?kcl、10-30mm(nh4)2so4、0.1-0.5mg/mlbsa、1-6mm?mgcl、0.2-0.6mm?dntp、3-10％甘油、0.5-5u/μltaq酶、0.5-5u/μl?pfu酶。

7、優(yōu)選的，所述pcr試劑盒包含如下組分：

8、40mm?tris-hcl(ph?9.0)、25mm?kcl、15mm(nh4)2so4、0.2mg/ml?bsa、2.5mm?mgcl、0.4mm?dntp、6％甘油、4u/μl?taq酶、4u/μl?pfu酶。

9、優(yōu)選的，所述pcr試劑盒制備方法為：

10、向去離子純化水中分別加入10-50mm?tris-hcl(ph?9.0)、20-40mm?kcl、10-30mm(nh4)2so4、0.1-0.5mg/ml?bsa、1-6mm?mgcl、0.2-0.6mm?dntp、3-10％甘油、0.5-5u/μl?taq酶、0.5-5u/μl?pfu酶，放置在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

11、優(yōu)選的，所述pcr試劑盒在動植物組織粗提模板擴(kuò)增方面的應(yīng)用。

12、(三)有益的技術(shù)效果

13、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是為了解決實(shí)驗(yàn)室在轉(zhuǎn)基因動植物基因分型鑒定工作中所面臨的復(fù)雜繁瑣、成本較高等問題。為此，本發(fā)明提出了一種簡便快捷、降低成本、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠的無需提取的pcr擴(kuò)增試劑。

14、試劑盒采用了一種簡便的提取試劑，能夠高效地從轉(zhuǎn)基因動植物組織中提取出純度較低但質(zhì)量高的dna樣品并直接進(jìn)行pcr的擴(kuò)增。相比傳統(tǒng)的提取方法，該試劑盒操作簡單方便，可以節(jié)省大量的時間和勞動力成本。此外，該試劑盒還具有較低的成本，能夠幫助實(shí)驗(yàn)室降低實(shí)驗(yàn)成本。使用該試劑盒，實(shí)驗(yàn)室無需購買昂貴的設(shè)備和試劑，只需按照說明書進(jìn)行操作即可完成轉(zhuǎn)基因動植物基因型的鑒定。

15、本發(fā)明致力于動物組織基因分型實(shí)驗(yàn)，主要用于簡化動物組織dna鑒定過程，1xlysis?buffer和蛋白酶k在低溫條件下使組織dna得到溫和的釋放，從而獲得完整的dna樣品，在裂解完成后對蛋白酶k進(jìn)行高溫滅活，使用優(yōu)化后的2x?pcr?mix進(jìn)行pcr擴(kuò)增測試不同轉(zhuǎn)基因小鼠尾巴的粗體dna，結(jié)果符合轉(zhuǎn)基因小鼠表型，此方法得到大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可大量使用到轉(zhuǎn)基因鑒定的繁瑣工作中。

16、綜上所述，本發(fā)明提出的轉(zhuǎn)基因動植物組織dna鑒定試劑盒具有簡便快捷、降低成本、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，可以有效解決實(shí)驗(yàn)室在轉(zhuǎn)基因動植物基因分型鑒定工作中的問題。

技術(shù)特征：

1.一種適用于動植物組織粗提模板擴(kuò)增的pcr試劑盒，其特征在于：所述pcr試劑盒由1x?lysis?buffer、20mg/ml的蛋白酶k、2x?direct?pcr?mix組成。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于動植物組織粗提模板擴(kuò)增的pcr試劑盒，其特征在于：所述pcr試劑盒包含如下組分：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種適用于動植物組織粗提模板擴(kuò)增的pcr試劑盒，其特征在于：所述pcr試劑盒包含如下組分：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于動植物組織粗提模板擴(kuò)增的pcr試劑盒，其特征在于：所述pcr試劑盒制備方法為：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于動植物組織粗提模板擴(kuò)增的pcr試劑盒，其特征在于：所述pcr試劑盒在動植物組織粗提模板擴(kuò)增方面的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，且公開了一種適用于動植物組織粗提模板擴(kuò)增的PCR試劑盒及其應(yīng)用，由1x?Lysis?Buffer、20mg/mL的蛋白酶k、2x?Direct?PCR?Mix組成。1x?Lysis?Buffer和蛋白酶k在低溫條件下使組織DNA得到溫和的釋放，從而獲得完整的DNA樣品，在裂解完成后對蛋白酶k進(jìn)行高溫滅活，使用優(yōu)化后的2x?PCR?Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增測試不同轉(zhuǎn)基因小鼠尾巴的粗提DNA。本發(fā)明提出的轉(zhuǎn)基因動植物組織DNA鑒定試劑盒具有簡便快捷、降低成本、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，可以有效解決實(shí)驗(yàn)室在轉(zhuǎn)基因動植物基因分型鑒定工作中的問題。

技術(shù)研發(fā)人員：李明陽,齊明霞,何文龍,王春香
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21