發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及通過使用微生物發(fā)酵生產(chǎn)rna(核糖核酸)的方法。

背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、作為通過使用微生物生產(chǎn)rna的方法，已知例如使用缺乏核糖核酸酶iii(rna酶iii)的大腸桿菌(escherichia?coli)作為宿主在細(xì)菌細(xì)胞中積累rna的方法(非專利文獻(xiàn)1)、與phi?6噬菌體的功能組合使用丁香假單胞菌(pseudomonas?syringae)作為宿主以在殼體中積累rna的方法(非專利文獻(xiàn)2)、使用大腸桿菌作為宿主在細(xì)菌細(xì)胞中積累與trna的部分序列融合的rna的方法(非專利文獻(xiàn)3)、使用大腸桿菌作為宿主在允許sirna與結(jié)合sirna的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的情況下生產(chǎn)sirna的方法(非專利文獻(xiàn)4)、使用小紅卵菌屬(rhodovulum)的細(xì)菌作為宿主以通過分泌產(chǎn)生來生產(chǎn)rna的方法(專利文獻(xiàn)1)、以及使用酵母作為宿主在酵母線粒體中積累rna的方法(專利文獻(xiàn)2)。

2、引用表

3、專利文獻(xiàn)

4、ptl?1：專利文獻(xiàn)1：wo2009/063969

5、ptl?2：專利文獻(xiàn)2：wo2010/084371

6、非專利文獻(xiàn)

7、npl?1：非專利文獻(xiàn)1：tenllado?f,et.al.,crude?extracts?of?bacteriallyexpressed?dsrna?can?be?used?to?protect?plants?against?virus?infections.bmcbiotechnol.2003mar?20；3:3.

8、npl?2：非專利文獻(xiàn)2：aalto?ap,et.al.,large-scale?production?of?dsrna?andsirna?pools?for?rna?interference?utilizing?bacteriophage?phi6?rna-dependentrna?polymerase.rna.2007mar；13(3):422-9.

9、npl?3：非專利文獻(xiàn)3：ponchon?l,et.al.,a?generic?protocol?for?theexpression?and?purification?of?recombinant?rna?in?escherichia?coli?using?atrna?scaffold.nat?protoc.2009；4(6):947-59.

10、npl?4：非專利文獻(xiàn)4：huang?l,et.al.,efficient?and?specific?geneknockdown?by?small?interfering?rnas?produced?in?bacteria.natbiotechnol.2013apr；31(4):350-6.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種有效生產(chǎn)rna的方法。

2、本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用缺乏核糖核酸酶iii(rna酶iii)的棒狀桿菌細(xì)菌作為宿主，可以有效地生產(chǎn)rna，從而完成了本發(fā)明。

3、因此，本發(fā)明可以例如如下實(shí)施。

4、[1].一種生產(chǎn)目標(biāo)rna的方法，所述方法包括：

5、在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有所述目標(biāo)rna的表達(dá)單元的棒狀桿菌細(xì)菌(coryneformbacterium)，以表達(dá)所述目標(biāo)rna并在所述細(xì)菌的細(xì)胞中積累所述目標(biāo)rna；并且

6、從所述細(xì)胞中收集所述目標(biāo)rna，

7、其中所述細(xì)菌已經(jīng)被修飾而使得與未經(jīng)修飾的菌株相比核糖核酸酶iii的活性降低。

8、[2].上述方法，其中所述核糖核酸酶iii是下述(a)、(b)或(c)中定義的蛋白質(zhì)：

9、(a)包含seq?id?no:52的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；

10、(b)包含seq?id?no:52的氨基酸序列，且該氨基酸序列包含1至10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加，并具有核糖核酸酶iii活性的蛋白質(zhì)；

11、(c)包含與seq?id?no:52的氨基酸序列顯示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并具有核糖核酸酶iii活性的蛋白質(zhì)。

12、[3].上述方法，其中通過減弱編碼核糖核酸酶iii的基因的表達(dá)或通過破壞所述基因來降低核糖核酸酶iii的活性。

13、[4].上述方法，其中通過缺失編碼核糖核酸酶iii的基因來降低核糖核酸酶iii的活性。

14、[5].上述方法，其中所述細(xì)菌具有拷貝數(shù)為5個(gè)拷貝/細(xì)胞或更多的所述表達(dá)單元。

15、[6].上述方法，其中所述細(xì)菌具有拷貝數(shù)為70個(gè)拷貝/細(xì)胞或更多的所述表達(dá)單元。

16、[7].上述方法，其中所述細(xì)菌具有含有所述表達(dá)單元的載體。

17、[8].上述方法，其中所述表達(dá)單元在5’至3’的方向上含有在所述棒狀桿菌細(xì)菌中起作用的啟動(dòng)子序列和編碼所述目標(biāo)rna的核苷酸序列。

18、[9].上述方法，其中所述啟動(dòng)子序列是源自噬菌體的啟動(dòng)子。

19、[10].上述方法，其中所述啟動(dòng)子序列是f1啟動(dòng)子或t7啟動(dòng)子。

20、[11].上述方法，其中所述啟動(dòng)子序列是下述(a)或(b)中定義的啟動(dòng)子：

21、(a)包含seq?id?no:13或78的核苷酸序列的啟動(dòng)子；

22、(b)包含與seq?id?no:13或78的核苷酸序列顯示90％或更高的同一性的核苷酸序列的啟動(dòng)子。

23、[12].上述方法，其中所述細(xì)菌是屬于棒桿菌屬的細(xì)菌。

24、[13].上述方法，其中所述細(xì)菌是谷氨酸棒桿菌(corynebacterium?glutamicum)。

技術(shù)特征：

1.一種生產(chǎn)目標(biāo)rna的方法，所述方法包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核糖核酸酶iii是包含seq?id?no:52的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中通過減弱編碼核糖核酸酶iii的基因的表達(dá)或通過破壞所述基因來降低核糖核酸酶iii的活性。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過缺失編碼核糖核酸酶iii的基因來降低核糖核酸酶iii的活性。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌具有拷貝數(shù)為5個(gè)拷貝/細(xì)胞或更多的所述表達(dá)單元。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)菌具有拷貝數(shù)為70個(gè)拷貝/細(xì)胞或更多的所述表達(dá)單元。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述表達(dá)單元在5’至3’的方向上含有在所述棒狀桿菌細(xì)菌中起作用的啟動(dòng)子序列和編碼所述目標(biāo)rna的核苷酸序列。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述啟動(dòng)子序列是源自噬菌體的啟動(dòng)子。

9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述啟動(dòng)子序列是f1啟動(dòng)子或t7啟動(dòng)子。

10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述啟動(dòng)子序列是包含seq?id?no:13或78的核苷酸序列的啟動(dòng)子。

技術(shù)總結(jié)
提供了一種生產(chǎn)RNA的方法。通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有目標(biāo)RNA的表達(dá)單元的棒狀桿菌細(xì)菌以表達(dá)所述目標(biāo)RNA并且在所述細(xì)菌細(xì)胞中積累所述目標(biāo)RNA，并且從所述細(xì)胞中收集所述目標(biāo)RNA來生產(chǎn)目標(biāo)RNA，所述棒狀桿菌細(xì)菌已經(jīng)被修飾而使得核糖核酸酶III的活性降低。

技術(shù)研發(fā)人員：羽城周平,安枝壽,三橋麻由,S·V·馬什科,A·A·科耶洛夫,Y·S·洛巴諾娃
受保護(hù)的技術(shù)使用者：味之素株式會(huì)社
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/17