本發(fā)明屬于生物，尤其涉及一種m2型丙酮酸激酶調(diào)節(jié)劑的篩選方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、丙酮酸激酶(pyruvate?kinase，pk)又叫磷酸丙酮酸激酶、丙酮酸磷轉(zhuǎn)移酶，廣泛分布于微生物、動物、植物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是糖酵解途徑最后一步反應(yīng)中催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，pep)和adp產(chǎn)生丙酮酸的酶，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。丙酮酸激酶在哺乳類動物中有4種同工酶，分別為pkl(l型)、pkr(r型)、pkm1(m1型)和pkm2(m2型)，pkm1和pkm2均由pkm基因編碼，pkm1主要以高活性的四聚體形式存在于大腦和肌肉等能量需求旺盛組織的分化終末細(xì)胞中；pkm2以低活性的二聚體和高活性的四聚體存在，其聚體和活性可受營養(yǎng)供應(yīng)的調(diào)節(jié)，以平衡組織對能量和合成的需求，因此主要在胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞和癌細(xì)胞等對合成代謝需求較強(qiáng)的細(xì)胞中表達(dá)。由于pkm2在癌癥發(fā)生發(fā)展中的重要作用，因此，發(fā)現(xiàn)pkm2調(diào)節(jié)劑(包括抑制劑或激活劑)對于包括癌癥在內(nèi)的pkm2相關(guān)疾病藥物的研發(fā)具有重要意義。

2、目前僅存在丙酮酸激酶的活性測定方法，丙酮酸激酶活性檢測的方法及反應(yīng)條件往往不能靈敏準(zhǔn)確的反應(yīng)丙酮酸激酶的活性變化而不適于篩選丙酮酸激酶的調(diào)節(jié)劑。因此，提供一種能夠靈敏、準(zhǔn)確的篩選m2型丙酮酸激酶調(diào)節(jié)劑的方法顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種m2型丙酮酸激酶調(diào)節(jié)劑的篩選方法，包括以下步驟：

2、將adp、磷酸烯醇式丙酮酸、m2型丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶與tris-hcl緩沖液混合得到反應(yīng)液1；

3、將nadh和上述反應(yīng)液1混合得到反應(yīng)液2；

4、將nadh、待篩選物和上述反應(yīng)液1混合得到反應(yīng)液3；

5、分別測定反應(yīng)液1、反應(yīng)液2、反應(yīng)液3的初始吸光度和反應(yīng)180～400s后的吸光度；

6、通過吸光度值計算待篩選物的活性，判定待篩選物是否為m2型丙酮酸激酶調(diào)節(jié)劑。

7、優(yōu)選的，所述adp、磷酸烯醇式丙酮酸、m2型丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶的添加比例為：0.8～1.2mm∶0.3～0.7mm∶15～30μg∶3～5u。

8、優(yōu)選的，所述反應(yīng)液2和反應(yīng)液3中，m2型丙酮酸激酶與nadh的添加比例為：15～30μg∶0.1～2mm。

9、優(yōu)選的，所述tris-hcl緩沖液的ph為6.8～7.2。

10、優(yōu)選的，所述吸光度測定的波長為340nm。

11、優(yōu)選的，計算待篩選物活性的公式為：

12、待篩選物活性(％)＝[(λ2-λ)-(λ2'-λ')]/[(λ1-λ)-(λ1'-λ')]

13、其中：λ為反應(yīng)液1的初始吸光度；λ'為反應(yīng)液1反應(yīng)180～400s后的吸光度；λ1為反應(yīng)液2的初始吸光度；λ1'為反應(yīng)液2反應(yīng)180～400s后的吸光度；λ2為反應(yīng)液3的初始吸光度；λ2'為反應(yīng)液3反應(yīng)180～400s后的吸光度。

14、優(yōu)選的，所述調(diào)節(jié)劑為激活劑或抑制劑。

15、優(yōu)選的，所述待篩選物活性大于100％時為激活劑，待篩選物活性小于100％時為抑制劑。

16、本發(fā)明還提供了所述篩選方法在制備m2型丙酮酸激酶調(diào)節(jié)劑篩選試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明的有益效果：

18、本發(fā)明通過測定加入外源調(diào)節(jié)劑前后nadh在340nm處光密度的減少間接獲得m2型丙酮酸激酶(pkm2)調(diào)節(jié)劑的有無或強(qiáng)弱，進(jìn)而完成對pkm2調(diào)節(jié)劑的篩選。本發(fā)明提供了一種篩選pkm2調(diào)節(jié)劑的方法，通過對檢測條件的優(yōu)化，能夠靈敏、準(zhǔn)確的對pkm2調(diào)節(jié)劑進(jìn)行篩選，供日后的科研使用。

技術(shù)特征：

1.一種m2型丙酮酸激酶調(diào)節(jié)劑的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述adp、磷酸烯醇式丙酮酸、m2型丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶的添加比例為：0.8～1.2mm∶0.3～0.7mm∶15～30μg∶3～5u。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述反應(yīng)液2和反應(yīng)液3中，m2型丙酮酸激酶與nadh的添加比例為：15～30μg∶0.1～2mm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述tris-hcl緩沖液的ph為6.8～7.2。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述吸光度測定的波長為340nm。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的篩選方法，其特征在于，計算待篩選物活性的公式為：

7.根據(jù)權(quán)利要求1～6任意一項所述的篩選方法，其特征在于，所述調(diào)節(jié)劑為激活劑或抑制劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的篩選方法，其特征在于，所述待篩選物活性大于100％時為激活劑，待篩選物活性小于100％時為抑制劑。

9.權(quán)利要求1～8任意一項所述篩選方法在制備m2型丙酮酸激酶調(diào)節(jié)劑篩選試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種M2型丙酮酸激酶調(diào)節(jié)劑的篩選方法及其應(yīng)用。本發(fā)明通過測定加入外源調(diào)節(jié)劑前后NADH在340nm處光密度的減少間接獲得M2型丙酮酸激酶(PKM2)調(diào)節(jié)劑的有無或強(qiáng)弱，進(jìn)而完成對PKM2調(diào)節(jié)劑的篩選。本發(fā)明通過對檢測條件的優(yōu)化，能夠靈敏、準(zhǔn)確的對PKM2調(diào)節(jié)劑進(jìn)行篩選。

技術(shù)研發(fā)人員：李靜,李思錚,高倩鈺,劉子瀟,張潔瑩,景小紅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南開大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21