本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種副雞禽桿菌弱毒株及其構建方法與應用。

背景技術：

1、副雞禽桿菌（ avibacterium?paragallinarum）是引發(fā)雞傳染性鼻炎的病原體，由于該病對肉雞生長和產蛋雞產蛋量的負面影響，給禽業(yè)造成了經濟損失。根據page分型方案，副雞禽桿菌分為a、b、c三個血清型。雖然存在不同血清型的疫苗，但它們常常無法提供足夠的交叉保護，且可能導致不良反應。此外，副雞禽桿菌變異株的出現(xiàn)與毒力增強可能會降低疫苗的保護效率，進而導致免疫失敗的情況。

2、目前，對于副雞禽桿菌的控制策略主要依賴生物安全措施和疫苗接種?，F(xiàn)有的疫苗主要是全菌滅活疫苗，疫苗中含有大量滅活菌體及附帶的脂多糖等毒副作用物質，使用后常常伴隨有比較嚴重的副作用，應激反應大。確?？乖甓玖p弱且免疫原性維持，同時避免毒力返強的風險是開發(fā)弱毒活疫苗的前提。因此，開發(fā)高效、低毒副作用且成本較低的新型減毒活疫苗，是養(yǎng)殖場雞傳染性鼻炎防控的理想之選。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的問題是現(xiàn)有的雞傳染性鼻炎疫苗保護效率不高或者使用后伴隨比較嚴重的副作用。

2、為解決上述問題，本發(fā)明提供一株副雞禽桿菌（ avibacterium?paragallinarum）弱毒株，其保藏編號為cgmcc?no.30442。

3、所述副雞禽桿菌弱毒株在制備雞傳染性鼻炎疫苗中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

4、優(yōu)選地，所述雞傳染性鼻炎疫苗為活疫苗。

5、本發(fā)明還提供一種疫苗，其包含所述的副雞禽桿菌弱毒株。

6、優(yōu)選地，所述疫苗為活疫苗。

7、優(yōu)選地，所述活疫苗含有5×104～5×106cfu/ml的副雞禽桿菌弱毒株。

8、優(yōu)選地，所述疫苗還包含藥學上可接受的免疫佐劑。

9、本發(fā)明還提供一種獲得副雞禽桿菌弱毒株的方法，其包括：對野生型副雞禽桿菌（ avibacterium?paragallinarum）中的谷胱甘肽還原酶基因進行基因敲除，得到副雞禽桿菌弱毒株。

10、所述谷胱甘肽還原酶基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

11、優(yōu)選地，所述方法包括如下步驟：

12、s1：從野生型副雞禽桿菌基因組中分別擴增谷胱甘肽還原酶基因的上游片段和下游片段，通過pcr將所述上游片段和下游片段連接并擴增得到同源重組片段，并將所述同源重組片段插入谷氨酸棒狀桿菌基因敲除載體，得到基因敲除重組質粒；

13、s2：將所述基因敲除重組質粒導入野生型副雞禽桿菌，培養(yǎng)后篩選谷胱甘肽還原酶基因被敲除的菌株，得到副雞禽桿菌弱毒株。

14、本發(fā)明通過敲除副雞禽桿菌的谷胱甘肽還原酶（gr）基因，獲得了保藏編號為cgmcc?no.30442的副雞禽桿菌弱毒株，命名為m-δgr。體外生長能力測定結果顯示，m-δgr株與野生型菌株相比生長能力降低了100倍，生物被膜形成能力顯著降低。黏附與侵襲能力測定結果顯示，m-δgr株與雞巨噬細胞hd11的相互作用明顯減弱。攻毒實驗結果顯示，m-δgr株的致病能力與野生型菌株相比顯著降低，在低攻毒劑量（1×104cfu/只至1×106cfu/只）下不會引起雞只發(fā)病，雖然在高攻毒劑量（1×107cfu/只至1×108cfu/只）仍會引起雞只發(fā)病，但是癥狀輕微、發(fā)病時間較短并且發(fā)病率低于100%。在致病能力降低的同時，m-δgr株保留了較強的免疫原性。經實驗證明，接種了m-δgr活疫苗的spf雞在經過野生型副雞禽桿菌攻擊后，保護率達到80%。

15、綜上，對副雞禽桿菌gr基因敲除突變株的表型分析及其與宿主細胞相互作用的研究，不僅深化了本領域對該病原體致病機制的理解，也為利用基因敲除技術開發(fā)新型疫苗的策略提供了重要的科學基礎。通過敲除gr基因構建的副雞禽桿菌弱毒株，在體外培養(yǎng)條件下可以正常生長，不僅能夠有效地激發(fā)spf雞的免疫反應，提供良好的保護效果，還不會引起明顯的不良反應，是一種潛在的新型活疫苗候選株，在防控雞傳染性鼻炎方面具有重要的應用價值。

16、本發(fā)明提供的副雞禽桿菌弱毒株的保藏信息如下：

17、保藏名稱：m-δgr

18、保藏號：cgmcc?no.30442

19、分類命名：副雞禽桿菌 avibacterium?paragallinarum

20、保藏日期：2024年4月25日

21、保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

22、地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。

技術特征：

1.一株副雞禽桿菌（avibacterium?paragallinarum）弱毒株，其保藏編號為cgmccno.30442。

2.權利要求1所述的副雞禽桿菌弱毒株在制備雞傳染性鼻炎疫苗中的應用。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述雞傳染性鼻炎疫苗為活疫苗。

4.一種疫苗，其包含權利要求1所述的副雞禽桿菌弱毒株。

5.根據權利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗為活疫苗。

6.根據權利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述活疫苗含有5×104～5×106?cfu/ml的副雞禽桿菌弱毒株。

7.根據權利要求4-6任一所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗還包含免疫佐劑。

8.一種獲得副雞禽桿菌弱毒株的方法，其包括：對野生型副雞禽桿菌（avibacterium?paragallinarum）中的谷胱甘肽還原酶基因進行基因敲除，得到副雞禽桿菌弱毒株。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述谷胱甘肽還原酶基因的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

10.根據權利要求8或9所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

技術總結
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種副雞禽桿菌弱毒株及其構建方法與應用。提供一株副雞禽桿菌（Avibacterium?paragallinarum）弱毒株，其保藏編號為CGMCC?No.30442。所述弱毒株不僅能夠有效地激發(fā)SPF雞的免疫反應，提供良好的保護效果，還不會引起明顯的不良反應，是一種潛在的新型活疫苗候選株，在防控雞傳染性鼻炎方面具有重要的應用價值。

技術研發(fā)人員：王宏俊,支巖,梅晨,劉穎,劉珍邑
受保護的技術使用者：北京市農林科學院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/10/21