本發(fā)明屬于生物，具體涉及到一種禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、禽致病性大腸桿菌(avian?pathogenic?escherichia?coli,apec)屬于腸外致病性大腸桿菌(extraintestinal?pathogenic?escherichia?coli,expec)，能夠引起禽類的大腸桿菌病，包括氣囊炎、心包炎、卵腹膜炎、肝周炎、臍炎、蜂窩組織炎等癥狀。隨著我國養(yǎng)禽業(yè)集約化規(guī)?；?，禽大腸桿菌病已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細菌病，造成嚴重經(jīng)濟損失。目前治療apec感染的方法主要基于藥物療法，但由于抗生素的廣泛使用導(dǎo)致apec耐藥菌株日益增多，隨著多重耐藥菌株的形成以及藥物殘留問題的增加，禽產(chǎn)品質(zhì)量安全越來越受到人們的重視。同時，國家頒布《遏制微生物耐藥國家行動計劃》來減少抗生素的不合理使用及抗生素替代產(chǎn)品的研發(fā)，因此，利用抗生素替代產(chǎn)品防控apec將是未來發(fā)展的必然趨勢，其中接種疫苗是有效防控禽大腸桿菌病發(fā)生和流行、減少禽產(chǎn)品污染及保證食品安全的重要途徑。

2、近年來，出現(xiàn)了一種新的疫苗模式，即由一系列表位組成的多表位疫苗。多表位疫苗是傳統(tǒng)減毒活疫苗和滅活疫苗的替代品，具有良好的安全性，并能引發(fā)針對特定表位的靶向免疫反應(yīng)，因此很有吸引力。b細胞和t細胞表位的鑒定對于多表位疫苗的開發(fā)至關(guān)重要。b細胞表位在啟動體液免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，而t細胞識別的t細胞表位則能誘導(dǎo)細胞免疫反應(yīng)，促進整體免疫激活。得益于計算免疫學和疫苗信息學的進步，現(xiàn)在有大量強大的工具可用于精確設(shè)計和開發(fā)基于表位的疫苗。計算設(shè)計已成為開發(fā)針對病毒、細菌、寄生蟲甚至癌癥等多種病原體的多表位疫苗的常用方法。此外，針對某些細菌疾病，如無乳癥鏈球菌和肺炎鏈球菌，多表位疫苗的開發(fā)工作也已展開。然而，迄今為止，尚未開展過專門針對apec的多表位疫苗研究。本發(fā)明首次進行了禽致病性大腸桿菌多表位融合蛋白的構(gòu)建，通過優(yōu)化禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白，使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，與toll樣受體結(jié)合效果更好，同時能夠引起更好的免疫原性與反應(yīng)原性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種禽致病性大腸桿菌多表位疫苗，即通過泛基因組分析生物信息學篩選出禽致病性大腸桿菌不同血清型基因組序列中免疫原性良好的蛋白并分析其表位，通過linker將輔助性t細胞表位，毒性t細胞表位及b細胞表位串聯(lián)獲得的抗原蛋白。

2、為了解決上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白，包括如下步驟：

4、利用泛基因組分析禽致病性大腸桿菌基因組，篩選出禽致病性大腸桿菌的核心基因。進一步通過亞細胞定位及抗原性分析獲取核心基因所在位置及抗原性，獲取位于胞外/膜外的高抗原性蛋白卷曲菌毛亞基csga、脂蛋白slyb、麥芽糖孔蛋白lamb、外膜蛋白phoe、蛋白水解酶激活劑nlpd和脂蛋白pal蛋白。進一步設(shè)計抗毒性t細胞表位、輔助性t細胞表位以及b細胞表位。通過linker進行將輔助性t細胞表位、毒性t細胞表位、b細胞表位串聯(lián)和不耐熱腸毒素ltb串聯(lián)融合蛋白。

5、首先，根據(jù)卷曲菌毛亞基csga、脂蛋白slyb、麥芽糖孔蛋白lamb、外膜蛋白phoe、蛋白水解酶激活劑nlpd和脂蛋白pal的氨基酸序列，通過netctl1.2在線預(yù)測毒性t細胞表位，iedb在線預(yù)測輔助性t細胞表位，abcpred在線預(yù)測b細胞表位。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，seq?idno.1-seq?id?no.22的毒性t細胞表位，seq?id?no.23-seq?id?no.32的輔助性t細胞表位，seq?id?no.33-seq?id?no.44的b細胞表位被選中用于apec抗原多表位融合蛋白的構(gòu)建。

6、基于卷曲菌毛亞基csga、脂蛋白slyb、麥芽糖孔蛋白lamb、外膜蛋白phoe、蛋白水解酶激活劑nlpd和脂蛋白pal的優(yōu)勢抗原表位，分別將ctl表位通過linker(aay)連接，htl表位通過linker(gpgpg)連接，b細胞表位通過linker(kk)連接，將不耐熱腸毒素ltb通過linker(eaaak)連接到融合蛋白的n端。并進行二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、過敏性、分子對接和免疫模擬分析。其氨基酸序列如seq?id?no.45所示。

7、結(jié)合第一方面，進一步的，本發(fā)明還提供了一種優(yōu)化的禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白的編碼基因序列，如seq?id?no.46所示。

8、另一方面，本發(fā)明還提供一種禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

9、根據(jù)優(yōu)化的基因序列進行基因合成，并插入表達載體pet28a(+)的bmah?i和hindⅲ酶切位點之間，構(gòu)建重組表達載體pet28a-mefa，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞，利用iptg誘導(dǎo)表達，優(yōu)選在0.05μg?iptg、28℃誘導(dǎo)過夜，離心收集菌體，破碎菌體并純化獲得抗原多表位融合蛋白。

10、再一方面，本發(fā)明還提供一種禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白的一種用途，是作為抗原制備疫苗中的應(yīng)用。

11、進一步的，本發(fā)明提供一種組合物，其中有效成分為上述禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白。

12、優(yōu)選的，本發(fā)明提供一種禽致病性大腸桿菌亞單位疫苗，包括上述禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白與免疫學上接受的疫苗佐劑以1：1體積配比混合，所述疫苗佐劑包括弗氏佐劑。

13、有益效果

14、與現(xiàn)有技術(shù)相比：通過泛基因組和反向疫苗學分析優(yōu)選設(shè)計了apec的6種蛋白的抗原多表位融合蛋白，血清型覆蓋廣，使用該蛋白制備亞單位疫苗具有更多衣殼蛋白抗原表位，刺激機體產(chǎn)生更多種類、更多數(shù)量的保護性抗體，顯著提高對禽致病性大腸桿菌的保護力。選擇的多抗原表位以及根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛性優(yōu)化多聯(lián)融合重組蛋白的編碼dna的密碼子，顯著提高了大腸桿菌表達系統(tǒng)表達多聯(lián)融合重組蛋白的蛋白量，保障了有充足的多聯(lián)融合重組蛋白用于制備禽致病性大腸桿菌亞單位疫苗。沒有過敏性，不會導(dǎo)致免疫動物過敏，安全性高?？乖啾砦蝗诤系鞍椎拿庖咴詮?，作為抗原制備疫苗，免疫動物后抗體效價較高，產(chǎn)生特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。而且本發(fā)明所制備多聯(lián)融合重組蛋白亞單位疫苗只需要簡單免疫即可以產(chǎn)生完全的免疫保護力，顯著降低了免疫防疫的成本支出。

技術(shù)特征：

1.一種優(yōu)化的禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白，其特征在于，包含優(yōu)選的卷曲菌毛亞基csga抗原表位、脂蛋白slyb抗原表位、麥糖孔蛋白lamb抗原表位、外膜蛋白phoe抗原表位、蛋白水解酶激活劑nlpd抗原表位和脂蛋白pal抗原表位、不耐熱腸毒素ltb，各抗原肽之間由通過linker串聯(lián)獲得的抗原蛋白，構(gòu)建apec抗原多表位融合蛋白。

2.如權(quán)利要求1所述的禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白，其中所述融合蛋白中含有seq?id?no.1-seq?id?no.22的毒性t細胞表位，seq?id?no.23-seq?id?no.32的輔助性t細胞表位，seq?id?no.33-seq?id?no.44的b細胞表位。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白，其特征在于，抗原多表位融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.45所示。

4.一種編碼權(quán)利要求1-3之一所述的禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白的核苷酸片段。

5.如權(quán)利要求4所述的核苷酸片段，其特征在于，核苷酸片段的序列如seq?id?no.46所示。

6.一種表達權(quán)利要求1所述禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白的表達方法，其特性在于，合成權(quán)利要求4所述的核苷酸片段，插入表達載體pet28a(+)的hindⅲ和bamhⅰ酶切位點之間，構(gòu)建重組表達載體pet28a-mefa，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞，利用iptg誘導(dǎo)表達，純化得到所述禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達方法，其特征在于：誘導(dǎo)條件為：0.05μg?iptg、28℃誘導(dǎo)，離心收集菌體，破碎并純化獲得抗原多表位融合蛋白。

8.權(quán)利要求1-3之一所述融合蛋白，和/或權(quán)利要求4-5之一所述核苷酸片段在制備禽致病性大腸桿菌疫苗中的應(yīng)用。

9.一種組合物，其中有效成分為權(quán)利要求1-3之一所述的禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白。

10.一種禽致病性大腸桿菌亞單位疫苗，包括權(quán)利要求1-3之一所述的禽致病性大腸桿菌抗原多表位融合蛋白與免疫學上接受的疫苗佐劑。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種禽致病性大腸桿菌六價多表位融合蛋白的制備方法及應(yīng)用，本發(fā)明優(yōu)選禽致病性大腸桿菌卷曲菌毛亞基CsgA、脂蛋白SlyB、麥芽糖孔蛋白LamB、外膜蛋白PhoE、蛋白水解酶激活劑NlpD和脂蛋白Pal主要結(jié)構(gòu)亞單位的抗原表位，并優(yōu)選地與不耐熱腸毒素LTb融合蛋白串聯(lián)構(gòu)建禽致病性大腸桿菌6種蛋白的抗原多表位融合蛋白。所述抗原多表位融合蛋白血清型覆蓋廣、無過敏性、免疫原性強，免疫動物后產(chǎn)生較強特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。

技術(shù)研發(fā)人員：王少輝,郭偉奇,胡劍剛,田明星,祁晶晶,鮑衍清
受保護的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心上海分中心）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21