本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及ntwrky33在調(diào)控?zé)煵葜薪禑焿A含量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、降煙堿是煙草中含量第二大生物堿，約占總生物堿的5％(sisson?and?severson1990)。降煙堿是煙草中一種不受歡迎的化學(xué)成分，除了直接影響煙草的香吃味外(roberts1988)，更重要的是在煙葉烘烤調(diào)制過程中，容易亞硝酸化形成潛在致癌物n'-亞硝基去甲煙堿(nnn)(peterson?et?al.2024；edwards?et?al.2017)。此外，降煙堿還可直接誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的異常糖基化，并與類固醇發(fā)生共價反應(yīng)，影響某些藥物的療效和毒性(dickerson?andjanda?2002)。因此，有必要降低煙草中的降煙堿含量。

2、降煙堿的生物合成途徑已基本清楚(dewey?and?xie?2013)，如下圖1所示，首先，精氨酸、鳥氨酸和天冬氨酸依次在精氨酸脫羧酶(adc)、鳥氨酸脫羧酶(odc)、腐胺n-甲基轉(zhuǎn)移酶(pmt)、n-甲基腐胺氧化酶(mpo)和喹啉酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(qpt)等酶的催化下在煙草的根部合成煙堿。然后，在mate和nup1(morita?et?al.2009；hildreth?et?al.

3、2011)的影響下，煙堿通過木質(zhì)部運輸?shù)饺~片。在葉片中，煙堿進(jìn)一步通過煙堿-n-去甲基酶(nnd)催化形成降煙堿。煙草葉片中降煙堿的積累與發(fā)育有關(guān)，在生長階段的綠葉中，降煙堿的含量很低，隨著衰老程度的加劇，降煙堿含量逐漸升高，最高為綠葉的30倍以上(chakrabarti?et?al.2008；gavilano?and?siminszky?2007；史宏志，2007)。在此過程中，cyp82e4(nte4)是負(fù)責(zé)煙堿-n-去甲基化的關(guān)鍵酶基因(siminszky?et?al.2005)。rnai誘導(dǎo)的nte4沉默導(dǎo)致植物的降煙堿水平顯著降低，比對照降低了93.8％(gavilano?etal.2006)。同樣，cyp82e4突變體的降煙堿含量比對照組降低了96％(lewis?et?al.2010)。盡管已經(jīng)明確nte4的差異表達(dá)是造成葉片中降煙堿積累的關(guān)鍵原因，但哪些基因參與了對nte4的調(diào)控、從而進(jìn)一步影響煙草葉片中降煙堿的合成仍不清楚。

4、wrky轉(zhuǎn)錄因子(tf)形成了植物中最豐富的家族之一。除了調(diào)節(jié)生物和非生物脅迫外，wrkys還參與植物衰老、形態(tài)發(fā)生和次生代謝產(chǎn)物(如木質(zhì)素、萜類化合物和類黃酮)的積累。煙草中有超過70個wrky家族成員。例如，ntwrky3、ntwrky9和tizz(ntwrky40)對tmv有反應(yīng)，ntwrky1、ntwrky和wizz(ntwrky40)對創(chuàng)傷有反應(yīng)。至今為止ntwrky33轉(zhuǎn)錄因子的功能還尚不確定。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明主要目的在于提供ntwrky33在調(diào)控?zé)煵葜薪禑焿A含量中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)ntwrky33是通過正向調(diào)控nte4表達(dá)參與衰老誘導(dǎo)的降煙堿合成的轉(zhuǎn)錄因子，并且通過實驗研究證明抑制ntwrky33可顯著降低降煙堿含量。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供ntwrky33在調(diào)控?zé)煵葜薪禑焿A含量中的應(yīng)用。

4、進(jìn)一步地，通過增強(qiáng)ntwrky33表達(dá)提高煙草中降煙堿含量，抑制ntwrky33表達(dá)降低煙草中降煙含量。

5、進(jìn)一步地，ntwrky33通過影響nte4基因的表達(dá)來調(diào)控降煙堿含量。

6、本發(fā)明提供抑制ntwrky33表達(dá)的產(chǎn)品在降低煙草中降煙堿含量中的應(yīng)用，所述產(chǎn)品通過抑制ntwrky33表達(dá)進(jìn)而降低nte4基因的表達(dá)，實現(xiàn)煙草中降煙堿含量的減少。

7、進(jìn)一步地，所述產(chǎn)品包括以下任意一種：

8、1)敲除ntwrky33的crispr/cas9系統(tǒng)；

9、2)含有1)所述crispr/cas9系統(tǒng)的微生物。

10、進(jìn)一步地，所述敲除ntwrky33的crispr/cas9系統(tǒng)由ntwrky33特異性靶向grna和crispr/cas9載體組成；

11、所述grna序列由seq?id?no.2-3所示。

12、進(jìn)一步地，所述crispr/cas9載體為pdc45。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

14、本發(fā)明在煙草中擴(kuò)增得到了轉(zhuǎn)錄因子ntwrky33，ntwrky33由衰老誘導(dǎo)，通過亞細(xì)胞定位顯示在細(xì)胞核中表達(dá)。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)敲除ntwrky33可顯著降低衰老葉片中的降煙堿含量，而過表達(dá)ntwrky33后降煙堿含量顯著升高。進(jìn)一步通過qrt-pcr分析表明，ntwrky33正向調(diào)節(jié)nte4的表達(dá)，而不顯著影響其他關(guān)鍵酶基因參與降煙堿合成。酵母單雜交(y1h)和雙熒光素酶分析(dla)表明ntwrky33通過與nte4啟動子結(jié)合直接促進(jìn)nte4的表達(dá)。

15、本發(fā)明首次確定ntwrky33是通過正向調(diào)控nte4表達(dá)參與衰老誘導(dǎo)的降煙堿合成的轉(zhuǎn)錄因子，為衰老誘導(dǎo)的降煙堿合成的分子機(jī)制提供了新的見解，并為調(diào)節(jié)降煙堿水平確定了一個新的目標(biāo)，具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)特征：

1.ntwrky33在調(diào)控?zé)煵葜薪禑焿A含量中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，通過增強(qiáng)ntwrky33表達(dá)提高煙草中降煙堿含量，抑制ntwrky33表達(dá)降低煙草中降煙含量。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，ntwrky33通過影響nte4基因的表達(dá)來調(diào)控降煙堿含量。

4.抑制ntwrky33表達(dá)的產(chǎn)品在降低煙草中降煙堿含量中的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品通過抑制ntwrky33表達(dá)進(jìn)而降低nte4基因的表達(dá)，實現(xiàn)煙草中降煙堿含量的減少。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括以下任意一種：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述敲除ntwrky33的crispr/cas9系統(tǒng)由ntwrky33特異性靶向grna和crispr/cas9載體組成；

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述crispr/cas9載體為pdc45。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及NtWRKY33在調(diào)控?zé)煵葜薪禑焿A含量中的應(yīng)用。本發(fā)明首次確定NtWRKY33是通過正向調(diào)控NtE4表達(dá)參與衰老誘導(dǎo)的降煙堿合成的轉(zhuǎn)錄因子，抑制NtWRKY33可顯著降低降煙堿含量。本發(fā)明為衰老誘導(dǎo)的降煙堿合成的分子機(jī)制提供了新的見解，并為調(diào)節(jié)降煙堿水平確定了一個新的目標(biāo)，具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)研發(fā)人員：李鳳霞,謝賀,張幸子,望錦,王雅琦,楊愛國
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所（中國煙草總公司青州煙草研究所）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21