本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物，具體涉及與大豆花葉病毒病相關(guān)的indel分子標記組合、引物組、檢測試劑盒和應用。

背景技術(shù)：

1、大豆(glycine?max(linn.)merr.)為豆科大豆屬植物，是我國重要的糧油飼兼用型作物，其是畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥、輕工、化工等行業(yè)的原料來源，經(jīng)濟價值高。

2、大豆花葉病毒病是由大豆花葉病毒(soybean?mosaic?virus，smv)引起的一種世界性大豆病害，當其侵染大豆后，嚴重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，一般年份造成的產(chǎn)量損失達35％～50％，個別年份甚至絕產(chǎn)。n3株系大豆花葉病毒是東北大豆產(chǎn)區(qū)的強致病株系，現(xiàn)有技術(shù)多通過化學藥劑對其進行化學防治，但使用化學藥劑防治的效果十分有限；而生物防治通過篩選抗性較強的親本進行雜交，以培育得到抗花葉病毒病的植株，但該方案不僅操作復雜且結(jié)果并不準確。目前，還未見通過indel分子標記輔助篩選、鑒定或培育抗花葉病毒病的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供與大豆花葉病毒病相關(guān)的indel分子標記組合、引物組、檢測試劑盒和應用，以此實現(xiàn)n3株系大豆花葉病毒病抗性品種的篩選、鑒定和培育。

2、本發(fā)明提供了與大豆花葉病毒病相關(guān)的indel分子標記組合，所述indel分子標記組合包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的第一indel分子標記和核苷酸序列如seq?idno.2所示的第二indel分子標記。

3、本發(fā)明提供了擴增上述技術(shù)方案所述indel分子標記組合的引物組，所述引物組包括擴增所述第一indel分子標記的第一引物和擴增所述第二indel分子標記的第二引物；所述第一引物包括上游引物f1和下游引物r1；所述第二引物包括上游引物f2和下游引物r2；所述上游引物f1的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述下游引物r1的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述上游引物f2的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；所述下游引物r2的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

4、本發(fā)明提供了一種檢測試劑盒，含有上述技術(shù)方案所述的引物組和pcr擴增試劑。

5、優(yōu)選的，所述pcr擴增試劑包括dna聚合酶、dntps和含有mg2+的試劑。

6、本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述的indel分子標記組合、所述的引物組或所述的檢測試劑盒的應用；所述應用包括篩選抗大豆花葉病毒植株、鑒定抗大豆花葉病毒植株和培育抗大豆花葉病毒植株中的一種或多種。

7、優(yōu)選的，所述大豆花葉病毒包括n3株系大豆花葉病毒。

8、本發(fā)明提供了一種篩選和/或鑒定大豆花葉病毒病抗性的方法，包括：

9、以待檢測大豆的基因組dna為模板，使用上述技術(shù)方案中所述的第一引物和第二引物分別進行pcr擴增，得到第一pcr擴增產(chǎn)物和第二pcr擴增產(chǎn)物；

10、分別對所述第一pcr擴增產(chǎn)物和第二pcr擴增產(chǎn)物進行核酸電泳帶型分析，并分別與墾豐17的核酸電泳帶型進行對比；

11、當所述第一pcr擴增產(chǎn)物的核酸電泳帶型和/或第二pcr擴增產(chǎn)物的核酸電泳帶型與墾豐17的核酸電泳帶型相同，則所述待檢測大豆不具有花葉病毒病抗性；

12、當所述第一pcr擴增產(chǎn)物的核酸電泳帶型和第二pcr擴增產(chǎn)物的核酸電泳帶型均與墾豐17的核酸電泳帶型不同，則所述待檢測大豆具有花葉病毒病抗性。

13、優(yōu)選的，所述pcr擴增的反應體系包括第一pcr擴增的反應體系和第二pcr擴增的反應體系；所述第一pcr擴增的反應體系以20μl計，包括：500ng/μl基因組dna模板1μl、10μm的上游引物f11μl、10μm的下游引物r11μl、2×taqpcrmix?10μl和ddh2o?7μl；所述第二pcr擴增的反應體系以20μl計，包括：500ng/μl基因組dna模板1μl、10μm的上游引物f21μl、10μm的下游引物r21μl、2×taqpcrmix?10μl和ddh2o?7μl。

14、優(yōu)選的，所述pcr擴增的程序均為：95℃預變性3min；94℃變性25s，58℃退火25s，72℃延伸8s，35個循環(huán)；72℃終止延伸10min。

15、優(yōu)選的，所述核酸電泳帶型分析方法包括：使用0.5×tbe溶液配制成質(zhì)量濃度為4％的瓊脂糖凝膠進行電泳；所述電泳的電壓為280v；所述電泳的時間為20min。

16、有益效果：

17、本發(fā)明提供了與大豆花葉病毒病相關(guān)的indel分子標記組合，所述indel分子標記組合包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的indel分子標記和核苷酸序列如seq?id?no.2所示的indel分子標記，該分子標記組合與n3株系大豆花葉病毒病緊密相關(guān)。進一步的，本發(fā)明基于indel分子標組合設(shè)計了相應的引物組和檢測試劑盒，以此能夠精準對抗n3株系花葉病毒病植株進行篩選、鑒定和培育。

18、基于上述技術(shù)優(yōu)勢，本發(fā)明還提供了一種篩選和/或鑒定大豆花葉病毒病抗性的方法，使用本發(fā)明提供的引物組對待測樣本進行pcr擴增，通過對pcr擴增產(chǎn)物進行核酸電泳帶型分析，并與墾豐17的核酸電泳帶型進行對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當所述pcr擴增產(chǎn)物的核酸電泳帶型與墾豐17的核酸電泳帶型相同時，則所述待檢測大豆不具有n3株系花葉病毒病抗性；當所述pcr擴增產(chǎn)物的核酸電泳帶型與墾豐17的核酸電泳帶型不同時，則所述待檢測大豆具有n3株系花葉病毒病抗性。以此，準確、快速的篩選、鑒定了大豆植株中n3株系花葉病毒病的抗性。

技術(shù)特征：

1.與大豆花葉病毒病相關(guān)的indel分子標記組合，其特征在于，所述indel分子標記組合包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的第一indel分子標記和核苷酸序列如seq?id?no.2所示的第二indel分子標記。

2.擴增權(quán)利要求1所述indel分子標記組合的引物組，其特征在于，所述引物組包括擴增所述第一indel分子標記的第一引物和擴增所述第二indel分子標記的第二引物；

3.一種檢測試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的引物組和pcr擴增試劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述pcr擴增試劑包括dna聚合酶、dntps和含有mg2+的試劑。

5.權(quán)利要求1所述的indel分子標記組合、權(quán)利要求2所述的引物組或權(quán)利要求3或4所述的檢測試劑盒的應用；

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述大豆花葉病毒包括n3株系大豆花葉病毒。

7.一種篩選和/或鑒定大豆花葉病毒病抗性的方法，其特征在于，包括：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述pcr擴增的反應體系包括第一pcr擴增的反應體系和第二pcr擴增的反應體系；

9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述pcr擴增的程序均為：95℃預變性3min；94℃變性25s，58℃退火25s，72℃延伸8s，35個循環(huán)；72℃終止延伸10min。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述核酸電泳帶型分析方法包括：使用0.5×tbe溶液配制成質(zhì)量濃度為4％的瓊脂糖凝膠進行電泳；所述電泳的電壓為280v；所述電泳的時間為20min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與大豆花葉病毒病相關(guān)的InDel分子標記組合、引物組、檢測試劑盒和應用。本發(fā)明所述InDel分子標記組合包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的InDel分子標記和核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的InDel分子標記，該分子標記組合與大豆花葉病毒病緊密相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進一步提供了InDel分子標記組合相應的引物組、檢測試劑盒以及篩選和/或鑒定大豆花葉病毒病抗性的方法。與傳統(tǒng)大豆花葉病毒病抗性鑒定方法相比，本發(fā)明的方法具有高通量、自動化、快速精準、不易受環(huán)境因素影響等優(yōu)點，為大豆抗花葉病毒病材料的分子標記輔助育種提供新的技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：孫連軍,吳月穎,肖國政,侯晶晶
受保護的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/12