本發(fā)明屬于生物，尤其涉及一種通過輻照pbmc滋養(yǎng)層細(xì)胞提高nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的方法。

背景技術(shù)：

1、自然殺傷細(xì)胞(nk細(xì)胞)為一種天然免疫細(xì)胞，具有直接殺傷惡性細(xì)胞能力，被認(rèn)為是一種極具前途的免疫治療工具。為了獲得大量的高純度和高細(xì)胞毒性的nk細(xì)胞，本領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)出了多種策略用于nk細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)，外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc細(xì)胞)滋養(yǎng)層培養(yǎng)是其中之一。

2、pbmc細(xì)胞是nk細(xì)胞的主要來源之一，具有采集容易、易于體外擴(kuò)增、無毒副作用等特點(diǎn)。但是pbmc細(xì)胞中nk細(xì)胞僅10％-15％，需要進(jìn)行大量的體外擴(kuò)增培養(yǎng)。對于pbmc來源的nk細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)通常采用因子法或使用飼養(yǎng)層細(xì)胞與細(xì)胞因子或/和抗體搭配的組合來刺激nk細(xì)胞的體外擴(kuò)增，常用因子法包括il-2+il-18、il-15+il-21+il-1、il-2+il-15+il-18的組合以及細(xì)胞因子il-2+il-12+il-18+抗cd56抗體+抗cd16抗體+抗cd355抗體的組合等(biondo,r.等，(2024)impact?of?il-21on?natural?killer?cell?proliferationand?function-a?mathematical?and?functional?assessment.biorxiv,2024-01；becker-hapak,m.k.,等，(2021)afusion?protein?complex?that?combines?il12,il15,and?il18signaling?to?induce?memory-like?nk?cells?for?cancercancerimmunology?research,9,1071-1087；parrish-novak,j.等，(2000)interleukin?21andits?receptor?are?involved?in?nk?cell?expansion?and?regulation?of?lymphocytefunction.nature,408(6808),57-63.)；滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)常用滋養(yǎng)層細(xì)胞與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子與抗體的聯(lián)合使用(shman,tatsiana?v.等，(2023)phenotypic?and?functionalcharacterisation?of?locally?produced?natural?killer?cells?ex?vivo?expandedwith?the?k562-41bbl-mbil21?cell?line.clinical?and?experimental?medicine?23,no.6:2551-2560；于明曉等，(2022)一種體外擴(kuò)增nk細(xì)胞的新方法.advances?in?clinicalmedicine?12:9059.)。這些不同的擴(kuò)增系統(tǒng)顯示出相當(dāng)不同的nk細(xì)胞擴(kuò)增效率水平，14天擴(kuò)增效率從數(shù)十倍到數(shù)百倍不等。

3、本發(fā)明人通過對滋養(yǎng)層pbmc細(xì)胞進(jìn)行輻照處理，極大提高了nk細(xì)胞的擴(kuò)增效率,并且有批間穩(wěn)定性且純度高的優(yōu)勢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，發(fā)明人對滋養(yǎng)層pbmc細(xì)胞進(jìn)行處理試驗(yàn)并分析nk細(xì)胞的擴(kuò)增情況，發(fā)現(xiàn)通過滋養(yǎng)層pbmc細(xì)胞進(jìn)行一定劑量的輻照處理，極大提高了nk細(xì)胞的擴(kuò)增效率。

2、因此，本發(fā)明涉及一種輻照pbmc提高nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，其包括步驟：

3、(1)將nk細(xì)胞以1-3×106的密度接種到培養(yǎng)容器中；

4、(2)將非nk的自體pbmc細(xì)胞以0.5-2×107濃度置于培養(yǎng)容器中；

5、(3)使用20-40gy的劑量輻照(2)中的非nk的自體pbmc細(xì)胞20-40分鐘；

6、(4)將(3)中獲得的輻照自體pbmc細(xì)胞以3-5×106的密度加入到培養(yǎng)容器中培養(yǎng)；

7、可選地，(5)重復(fù)步驟(2)-(4)2-5次。

8、優(yōu)選地，步驟(1)中nk細(xì)胞接種密度為2×106；步驟(2)中非nk的自體pbmc細(xì)胞密度為1×107；步驟(3)中輻照劑量為30gy，輻照時(shí)間為30分鐘；步驟(4)中，輻照自體pbmc細(xì)胞以5×106的密度加入。

9、此外，本發(fā)明還涉及輻照pbmc處理在nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中的應(yīng)用。優(yōu)選地，輻照pbmc處理是以20-40gy的劑量輻照20-40分鐘，更優(yōu)選地輻照pbmc處理是以30gy的劑量輻照30分鐘。

10、發(fā)明詳述

11、本發(fā)明人對滋養(yǎng)層pbmc細(xì)胞進(jìn)行處理試驗(yàn)并分析nk細(xì)胞的擴(kuò)增情況，發(fā)現(xiàn)通過滋養(yǎng)層pbmc細(xì)胞進(jìn)行一定劑量的輻照處理，極大提高了nk細(xì)胞的擴(kuò)增效率。

12、因此，本發(fā)明人發(fā)明了一種輻照pbmc提高nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，其包括步驟：

13、(1)將nk細(xì)胞以1-3×106的密度接種到培養(yǎng)容器中；

14、(2)將非nk的自體pbmc細(xì)胞以0.5-2×107濃度置于培養(yǎng)容器中；

15、(3)使用20-40gy的劑量輻照(2)中的非nk的自體pbmc細(xì)胞20-40分鐘；

16、(4)將(3)中獲得的輻照自體pbmc細(xì)胞以3-5×106的密度加入到培養(yǎng)容器中培養(yǎng)；

17、可選地，(5)重復(fù)步驟(2)-(4)2-5次。重復(fù)輻照并加入非nk的自體pbmc步驟不是必須的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體的nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)情況確定是否重復(fù)輻照并加入非nk的自體pbmc步驟，以及重復(fù)輻照并加入非nk的自體pbmc的間隔時(shí)間。本發(fā)明后附實(shí)施例中僅示例性地在day7重復(fù)輻照并加入非nk的自體pbmc一次。

18、并且發(fā)明人進(jìn)一步地發(fā)現(xiàn)了具備最優(yōu)效果的參數(shù)，例如步驟(1)中nk細(xì)胞接種密度為2×106；步驟(1)中非nk的自體pbmc細(xì)胞密度為1×107；步驟(3)中輻照劑量為30gy，輻照時(shí)間為30分鐘；步驟(4)中，輻照自體pbmc細(xì)胞以5×106的密度加入。

19、因此，在本發(fā)明中，輻照pbmc處理可以應(yīng)用于nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中，并能夠提高nk細(xì)胞的擴(kuò)增效率。優(yōu)選地，輻照pbmc處理是以20-40gy的劑量輻照20-40分鐘，更優(yōu)選地輻照pbmc處理是以30gy的劑量輻照30分鐘。

20、在本發(fā)明中，培養(yǎng)容器是本領(lǐng)域眾所周知的，例如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)袋等。在本發(fā)明中具體實(shí)施方案中，使用了t75培養(yǎng)瓶。

21、在本發(fā)明中，非nk的自體pbmc細(xì)胞是指t細(xì)胞、b細(xì)胞以及單核細(xì)胞。

22、在本發(fā)明中，輻照是指用輻射照射的方法對被輻照物進(jìn)行處理，一般是指利用放射源的輻射進(jìn)行照射，具體的輻照步驟按照輻照設(shè)備的說明書進(jìn)行即可。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的有益效果為經(jīng)過輻照處理自體pbmc細(xì)胞后，nk細(xì)胞的擴(kuò)增效率提高10倍左右，14-17天擴(kuò)增1000倍左右，并且本發(fā)明方法具有批間穩(wěn)定性且純度高的優(yōu)勢，可以用于后續(xù)的治療等應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.一種輻照pbmc提高nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，其包括步驟：

2.權(quán)利要求1所述的方法，其中：

3.權(quán)利要求1所述的方法，其中：

4.權(quán)利要求1所述的方法，其中：

5.權(quán)利要求1-4所述的方法，其中：

6.輻照pbmc處理在nk細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中的應(yīng)用。

7.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中輻照pbmc處理是以20-40gy的劑量輻照20-40分鐘。

8.權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中輻照pbmc處理是以30gy的劑量輻照30分鐘。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種通過輻照PBMC滋養(yǎng)層細(xì)胞提高NK細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的方法。本發(fā)明方法通過將非NK自體PBMC滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行20?40Gy的劑量輻照后，NK細(xì)胞的擴(kuò)增效率提高10倍左右，14?17天擴(kuò)增1000倍左右，并且本發(fā)明方法具有批間穩(wěn)定性且純度高的優(yōu)勢，可以用于后續(xù)的治療等應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：代東發(fā),李琦,楊亞亞,王雪豐
受保護(hù)的技術(shù)使用者：亦諾興創(chuàng)（北京）生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/29