本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種山葡萄抗病基因vawrky14及其其在調(diào)控灰霉病抗性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、葡萄(vitis)是世界四大水果之一，據(jù)oiv統(tǒng)計，2021年我國葡萄種植面積達到78.3公頃，居世界第三位，葡萄在我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展中占有十分重要的地位?；颐共?botrytis?cinerea)是嚴(yán)重危害葡萄產(chǎn)業(yè)的一種真菌病害，全球每年由灰霉病導(dǎo)致20％～40％葡萄減產(chǎn)，嚴(yán)重的可達60％以上，并隨著設(shè)施栽培的廣泛應(yīng)用而日趨嚴(yán)重。目前灰霉病主要通過化學(xué)農(nóng)藥和生物防治來控制，但效果不佳，不僅增加葡萄栽培管理成本、污染環(huán)境，而且嚴(yán)重影響葡萄產(chǎn)品質(zhì)量。國內(nèi)外研究和育種實踐證明，利用植物自身抗病基因，培育優(yōu)質(zhì)抗病葡萄新品種是長期有效安全控制葡萄真菌病害的重要措施之一。

2、wrky轉(zhuǎn)錄因子是高等植物特有的鋅指型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其家族成員是調(diào)控許多植物生物脅迫、非生物脅迫以及生長發(fā)育進程的信號網(wǎng)絡(luò)的組成部分。近年來，wrky轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)灰霉菌反應(yīng)中的作用逐漸受到關(guān)注。然而，wrky轉(zhuǎn)錄因子基因在植物抗灰霉病特別是葡萄抗灰霉病中是否發(fā)揮關(guān)鍵作用尚有待研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種山葡萄抗病基因vawrky14及在其調(diào)控灰霉病抗性中的應(yīng)用。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明第一方面，提供一種山葡萄抗病基因vawrky14，所述基因vawrky14的dna序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明第二方面，提供一種所述基因vawrky14編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如seqid?no.2所示。

5、本發(fā)明第三方面，提供一種包含上述基因vawrky14的重組載體。

6、優(yōu)選地，所述重組載體為農(nóng)桿菌過表達載體。

7、本發(fā)明第四方面，提供一種擴增所述基因vawrky14的引物，所述引物序列為：

8、vawrky14-sak-f：

9、atccaaagaattccccggtaccatggcatcgggggattactcgcagg；

10、vawrky14-sak-r:

11、catgatctttgtaatcctcgagttaataaaaaggagggtgagaagaa。

12、本發(fā)明第五方面，提供一種所述基因vawrky14亞細(xì)胞定位方法，具體為：

13、設(shè)計帶有限制性酶切位點的特異引物擴增基因vawrky14的cds序列，利用同源重組方法將基因vawrky14整合到亞細(xì)胞定位載體pcambia2300-35s-gfp上，構(gòu)建pcambia2300-35s-vawrky14-gfp重組質(zhì)粒，通過熱激法轉(zhuǎn)化至gv3101農(nóng)桿菌。引物序列如下：

14、vawrky14-2300-gfp-f：

15、acgggggacgagctcggtaccatggcatcgggggattactcgcagg；

16、vawrky14-2300-gfp-r：

17、ggtgtcgactctagaggatccataaaaaggagggtgagaagaagtt。

18、本發(fā)明第六方面，提供一種vawrky14基因過表達載體的構(gòu)建方法，具體為：

19、設(shè)計帶有限制性酶切位點的特異引物擴增vawrky14基因的cds序列，利用同源重組方法將vawrky14基因整合到過表達載體psak277上，構(gòu)建psak277-vawrky14重組質(zhì)粒，通過熱激法轉(zhuǎn)化至gv3101農(nóng)桿菌。引物序列如下：

20、vawrky14-sak-f：

21、atccaaagaattccccggtaccatggcatcgggggattactcgcagg；

22、vawrky14-sak-r:

23、catgatctttgtaatcctcgagttaataaaaaggagggtgagaagaa。

24、本發(fā)明第七方面，提供一種所述基因vawrky14或所述的蛋白質(zhì)在提高植物灰霉病抗性中的應(yīng)用。

25、優(yōu)選地，所述基因vawrky14或者所述蛋白質(zhì)用于緩解活性氧爆發(fā)程度、提高抗氧化能力或激活抗病相關(guān)基因表達。

26、本發(fā)明第八方面，提供一種灰霉病抗性提高的植株的培育方法，是促進所述基因vawrky14的表達來實現(xiàn)。

27、優(yōu)選地，灰霉病抗性提高的植株的培育方法具體包括以下步驟：

28、構(gòu)建含有所述基因vawrky14的過表達載體；

29、將含有所述基因vawrky14的過表達載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后接種至植株上，獲得抗灰霉病的植物株系。

30、優(yōu)選地，所述植株為煙草或山葡萄。

31、本發(fā)明通過在煙草中異源過表達和在葡萄葉片中瞬時過表達vawrky14驗證了該基因的功能，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，該基因能夠提高葡萄對灰霉病的抗性，具體表現(xiàn)為：葡萄葉片感病面積降低，h2o2和o2.-的產(chǎn)生和積累增多，cat、pod和aao酶活性升高，防御相關(guān)基因如ntpod、ntpal、ntpdf1.2和ntpr1a/b更早更強烈地被激活。

32、本發(fā)明的優(yōu)點：

33、本發(fā)明公開了一種基因vawrky14及其在調(diào)控灰霉病抗性的應(yīng)用，分析了該基因在不同抗性葡萄材料中被灰霉菌誘導(dǎo)后的表達模式，利用異源過表達和瞬時過表達驗證vawrky14基因在調(diào)控灰霉病抗性中的作用，發(fā)現(xiàn)過表達vawrky14基因的葡萄葉片與對照葉片相比，活性氧爆發(fā)程度明顯緩解，抗氧化能力顯著增強，抗病相關(guān)基因表達顯著提高，從而降低了植株葉片壞死程度，增強了其抗灰霉病的能力。說明該基因可以調(diào)控葡萄葉片對灰霉病的抗性，對培育抗病的葡萄新品種具有積極的指導(dǎo)作用，有利于從分子機制上闡明山葡萄轉(zhuǎn)錄因子vawrky14在調(diào)控灰霉病抗性中的作用，為葡萄抗病分子育種提供理論基礎(chǔ)和基因資源。

34、對于一些在栽培生產(chǎn)過程中極易遭受灰霉病侵害的葡萄品種，可以通過過表達轉(zhuǎn)錄因子vawrky14基因或者同源基因的方式培育一些抗病新品種。

技術(shù)特征：

1.山葡萄抗病基因vawrky14，其特征在于，所述基因vawrky14的核苷酸序列如seq?idno.1所示。

2.一種權(quán)利要求1所述的基因vawrky14編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

3.一種包含權(quán)利要求1所述基因vawrky14的重組載體或重組質(zhì)粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為農(nóng)桿菌過表達載體。

5.一種權(quán)利要求1所述的基因vawrky14或權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)在提高植物灰霉病抗性中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因vawrky14或者所述蛋白質(zhì)用于緩解活性氧爆發(fā)程度、提高抗氧化能力或激活抗病相關(guān)基因表達。

7.一種灰霉病抗性提高的植株的培育方法，其特征在于，是促進權(quán)利要求1所述基因vawrky14的表達來實現(xiàn)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，該方法具體是按照以下步驟進行：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述植株為煙草或山葡萄。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種山葡萄抗病基因VaWRKY14及其應(yīng)用。本發(fā)明分析了該基因在不同抗性葡萄材料中受灰霉菌誘導(dǎo)后的表達模式，利用異源過表達和瞬時過表達驗證VaWRKY14基因在葡萄調(diào)控灰霉病抗性中的作用，發(fā)現(xiàn)過表達VaWRKY14基因的葡萄葉片與對照葉片相比，活性氧爆發(fā)程度緩解、抗氧化能力增強和抗病相關(guān)基因表達提高，說明該基因可以調(diào)控葡萄灰霉病抗性，對培育抗灰霉病的葡萄新品種具有積極的指導(dǎo)作用。

技術(shù)研發(fā)人員：萬然,高敏,楊振鋒,楊智淇,劉俊,鄭先波,王西平
受保護的技術(shù)使用者：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/29