本發(fā)明涉及一種d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d(簡(jiǎn)稱差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d)及其應(yīng)用，屬于酶工程。

背景技術(shù)：

1、d-阿洛酮糖(d-psicose)是自然界中含量極少的一種六碳糖，d-阿洛酮糖是一種低能量、不消化的食糖替代品，其具有降低血糖的功效，目前被國(guó)外許多制藥企業(yè)當(dāng)做甜味添加劑使用。此外，因d-阿洛酮糖可以通過(guò)美拉德反應(yīng)使得食物具有較好的持水性，在食品領(lǐng)域用處廣泛。d-阿洛酮糖還具有：(1)降低血糖，可作為ⅱ型糖尿病人的輔助治療劑、膳食補(bǔ)充劑和甜味劑；(2)降低血脂，減少脂肪合成酶活性，抑制腹腔內(nèi)脂肪堆積；(3)抗氧化活性，具有很強(qiáng)的活性氧(ros)清除能力及谷胱甘肽還原能力；(4)神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用等。

2、d-阿洛酮糖是果糖的c-3位置的差向異構(gòu)體，而d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(d-allulose-3-epimerase，daease)是一類能將果糖進(jìn)行c-3位置差向異構(gòu)化生產(chǎn)d-阿洛酮糖的酶，目前大約有20多種daease。目前多數(shù)研究針對(duì)酶的單方面性能(如耐熱或耐堿)的研究，而對(duì)轉(zhuǎn)化率的研究很少。

3、中國(guó)專利文獻(xiàn)cn?106148311?a(申請(qǐng)?zhí)枺?01610818847.x)公開(kāi)一種d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體，以來(lái)源于burkholderia?sp.mr1的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶為模板，至少為以下突變中的一個(gè)：第86位氨基酸殘基從甘氨酸變成天冬氨酸，第164位的氨基酸殘基從天冬氨酸變成谷氨酸，第262位氨基酸殘基從色氨酸變成絲氨酸。該發(fā)明提供的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體，含有g(shù)86d、d164e、w262s突變位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)。

4、中國(guó)專利文獻(xiàn)cn?108239633?a(申請(qǐng)?zhí)枺?01611217802.3)公開(kāi)了一種催化活性得到提高的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體，野生型d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶來(lái)自于類芽孢桿菌(paenibacillus?senegalensis)，其突變包括以下至少3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變：第73位天冬氨酸(d)、第111位酪氨酸(y)、第188位天冬酰胺(n)、第250位甘氨酸(g)。

5、中國(guó)專利文獻(xiàn)cn?110438112?a(申請(qǐng)?zhí)枺?01910757830.1)公開(kāi)了一種d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的突變體，該d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶來(lái)自集胞藻屬(synechocystis)，其突變體所發(fā)生突變的氨基酸的突變位點(diǎn)為第39位的i突變?yōu)閍，可選的突變位點(diǎn)還包括如下任意一個(gè)：第158位的q突變?yōu)閟，第186位的l突變?yōu)関。

6、現(xiàn)有技術(shù)中的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體的催化活性有一定的提高，但是提高幅度有限；針對(duì)不同來(lái)源的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行基因工程改造，以獲得性質(zhì)更加優(yōu)良的突變體，仍然具有重大研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明通過(guò)對(duì)位于d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶氨基酸序列將氨基酸序列中第33位的異亮氨酸(i)、第213位的絲氨酸(s)、第214位的天冬酰胺(n)進(jìn)行nnk突變，篩選最佳突變體，得到改造后的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d轉(zhuǎn)化能力顯著提高，其轉(zhuǎn)化率由32.9％提高到了40.4％。

3、本發(fā)明技術(shù)方案如下：

4、一種d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d，是在野生型d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶氨基酸序列上進(jìn)行突變，將氨基酸序列中第33位的異亮氨酸(i)突變?yōu)榱涟彼?l)，第213位的絲氨酸(s)突變?yōu)楦拾彼?g)，第214位的天冬酰胺(n)突變?yōu)樘於彼?d)，所述野生型d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

5、上述突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因，根據(jù)氨基酸的突變位點(diǎn)，在野生型d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的編碼核苷酸序列seq?id?no.2上，進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得。

6、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

7、一種重組表達(dá)載體，包含上述d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因。

8、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體的載體質(zhì)粒為pet-20b(+)。

9、一種重組菌株，包含上述d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因。

10、根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述重組菌株的宿主菌為大腸桿菌。

11、上述d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d在生產(chǎn)d-阿洛酮糖中的應(yīng)用。

12、上述突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因、重組表達(dá)載體或重組菌株在制備d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d中的應(yīng)用。

13、上述突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因、重組表達(dá)載體或重組菌株在生產(chǎn)d-阿洛酮糖中的應(yīng)用。

14、有益效果

15、本發(fā)明提供了一種d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體，具體地，是將來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的第33位的異亮氨酸(i)突變?yōu)榱涟彼?l)，第213位的絲氨酸(s)突變?yōu)楦拾彼?g)，第214位的天冬酰胺(n)突變?yōu)樘於彼?d)；本發(fā)明提供的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體-i33l/s213g/n214d與原始酶dpease相比，d-阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率提高了7.5％，轉(zhuǎn)化能力顯著提高，最適催化溫度由原始酶dpease的55℃提高至65℃，在酸性條件下(ph?5.0)的耐受性提高了5％。本發(fā)明提供的d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體-i33l/s213g/n214d拓寬了d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的應(yīng)用范圍，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d，是在野生型d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶氨基酸序列上進(jìn)行突變，將氨基酸序列中第33位的異亮氨酸(i)突變?yōu)榱涟彼?l)，第213位的絲氨酸(s)突變?yōu)楦拾彼?g)，第214位的天冬酰胺(n)突變?yōu)樘於彼?d)，所述野生型d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

2.權(quán)利要求1所述突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因，其特征在于，根據(jù)氨基酸的突變位點(diǎn)，在野生型d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的編碼核苷酸序列seq?id?no.2上，進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得。

3.權(quán)利要求1所述突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因，其特征在于，所述突變體i33l/s213g/n214d編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

4.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，包含權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因。

5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體的載體質(zhì)粒為pet-20b(+)。

6.一種重組菌株，其特征在于，包含權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因。

7.如權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株的宿主菌為大腸桿菌。

8.權(quán)利要求1所述突變體i33l/s213g/n214d在生產(chǎn)d-阿洛酮糖中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因、權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體或權(quán)利要求5所述重組菌株在制備d-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶突變體i33l/s213g/n214d中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述突變體i33l/s213g/n214d的編碼基因、權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體或權(quán)利要求5所述重組菌株在生產(chǎn)d-阿洛酮糖中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種差向異構(gòu)酶突變體及其應(yīng)用，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，一種D?阿洛酮糖?3?差向異構(gòu)酶突變體I33L/S213G/N214D，是在野生型D?阿洛酮糖?3?差向異構(gòu)酶氨基酸序列上進(jìn)行突變，將氨基酸序列中第33位的異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?，?13位的絲氨酸突變?yōu)楦拾彼?，?14位的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼幔鲆吧虳?阿洛酮糖?3?差向異構(gòu)酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述突變體在生產(chǎn)D?阿洛酮糖中的應(yīng)用；本發(fā)明提供的突變體與原始酶DPEase相比，D?阿洛酮糖轉(zhuǎn)化率提高了7.5％，轉(zhuǎn)化能力顯著提高，最適催化溫度由55℃提高至65℃，在酸性條件下的耐受性提高了5％。

技術(shù)研發(fā)人員：王瑞明,馮哲,汪俊卿,崔泉,李丕武,蘇靜,王婷,范翰
受保護(hù)的技術(shù)使用者：齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21