本發(fā)明屬于動物分子生物學(xué)dna標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用，具體涉及與禾花鯉生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鯉(cyprinus?carpio?linnaeus)作為重要的經(jīng)濟魚類廣泛養(yǎng)殖于歐亞大陸(biermann?and?geist，2019)，由于地理隔離和人工選擇等因素影響，鯉魚地方種群較多。禾花鯉泛指在華南地區(qū)稻田養(yǎng)殖的溫水性鯉魚，因魚采食禾花后魚肉具有禾花香味而得名“禾花鯉”。我國粵北山區(qū)的稻田禾花鯉養(yǎng)殖歷史悠久，稻漁綜合種養(yǎng)模式具有“以漁促稻、穩(wěn)糧增效、質(zhì)量安全和生態(tài)環(huán)保”的優(yōu)點，已成為發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟的重要途徑之一。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)稻田養(yǎng)殖的禾花鯉因未經(jīng)過系統(tǒng)選育，因此種質(zhì)混雜，生長速度慢，且體型各異。為增加稻田養(yǎng)殖禾花鯉的經(jīng)濟效益，提高禾花鯉的產(chǎn)量，以生長速度和短圓體型為指標(biāo)，對粵北地區(qū)現(xiàn)有的禾花鯉材料進(jìn)行選育。

2、在開展常規(guī)選育研究的同時，開發(fā)和應(yīng)用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)可加快本研究中禾花鯉(cyprinus?carpio?rubrofuscus)良種選育進(jìn)程。snp是指基因組dna序列中由于單個核苷酸變異而產(chǎn)生的多態(tài)性，位于基因編碼區(qū)的非同義snp可導(dǎo)致氨基酸的變化，從而影響蛋白質(zhì)的功能，特別是發(fā)生在結(jié)構(gòu)功能區(qū)域的snp尤其重要，最終引起生物表型的變化；位于啟動子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域的snp也可能對基因表達(dá)調(diào)控有影響，間接調(diào)控生物表型性狀。因snp標(biāo)記具有數(shù)量大、分型結(jié)果可靠、易于自動化批量檢測和易于計算機分析結(jié)果等優(yōu)點是尋找禾花鯉生長相關(guān)標(biāo)記的首選。本研究團隊前期通過重測序篩選了一批生長性狀相關(guān)的候選標(biāo)記，通過擴大群體進(jìn)一步驗證，旨在尋找禾花鯉生長相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為分子標(biāo)記輔助選育快長禾花鯉新品種選育提供基礎(chǔ)資料。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明通過利用分子遺傳學(xué)及分子生物學(xué)的方法獲得禾花鯉生長相關(guān)的snp分子標(biāo)記，所述snp分子標(biāo)記可用于快長禾花鯉新品種(系)選育。

2、本發(fā)明第一方面的目的，在于提供與禾花鯉生長性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記。

3、本發(fā)明第二方面的目的，在于提供用于擴增本發(fā)明第一方面的snp分子標(biāo)記的引物組。

4、本發(fā)明第三方面的目的，在于提供一種試劑盒。

5、本發(fā)明第四方面的目的，在于提供本發(fā)明第一方面的snp分子標(biāo)記、本發(fā)明第二方面的引物組和/或本發(fā)明第三方面的試劑盒的應(yīng)用。

6、本發(fā)明第五方面的目的，在于提供一種篩選禾花鯉生長快慢的方法。

7、本發(fā)明第六方面的目的，在于提供本發(fā)明第五方面的方法在選育生長優(yōu)異禾花鯉品種中的應(yīng)用。

8、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

9、本發(fā)明的第一個方面，提供與禾花鯉生長性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記，所述snp分子標(biāo)記的序列如seq?id?no:1所示，snp位點位于seq?id?no:1所示序列自5’端起第1001位，其多態(tài)性為a/g。

10、在本發(fā)明一些實施方式中，當(dāng)snp位點的基因型為gg，則禾花鯉的生長性狀為生長劣勢，當(dāng)snp位點的基因型為aa，禾花鯉的生長性狀為生長優(yōu)勢。

11、本發(fā)明的第二個方面，提供用于擴增本發(fā)明第一方面的snp分子標(biāo)記的引物組。

12、在本發(fā)明一些實施方式中，所述引物組的核苷酸序列如下所示：

13、f：5'-tcacatcatgctcccccaac-3'(seq?id?no:2)；

14、r：5'-taagcttcccaatcctctgc-3'(seq?id?no:3)。

15、本發(fā)明的第三個方面，提供一種包含本發(fā)明第二方面的引物組的試劑盒。

16、在本發(fā)明一些實施方式中，所述試劑盒還包括pcr中使用的緩沖液。

17、在本發(fā)明一些實施方式中，所述pcr中使用的緩沖液為pcr擴增所需要的任何試劑，比如dntp、taq酶、mgcl2等。

18、本發(fā)明第四個方面，提供本發(fā)明第一方面的snp分子標(biāo)記、本發(fā)明第二方面的引物組和/或本發(fā)明第三方面的試劑盒在(1)～(4)中任一項中的應(yīng)用：

19、(1)禾花鯉輔助選育或育種；

20、(2)制備禾花鯉輔助選育或育種的產(chǎn)品；

21、(3)判斷或鑒別禾花鯉生長快慢；

22、(4)制備判斷或鑒別禾花鯉生長快慢的產(chǎn)品。

23、在本發(fā)明一些實施方式中，所述選育為篩選得到體重、全長和體長優(yōu)異的禾花鯉品種(系)。

24、本發(fā)明的第五個方面，提供一種篩選禾花鯉生長快慢的方法，通過檢測待測禾花鯉的基因組中本發(fā)明第一方面的snp分子標(biāo)記的基因型，根據(jù)基因型確定所述待禾花鯉的生長快慢。

25、在本發(fā)明一些實施方式中，以待測禾花鯉dna為模板，使用本發(fā)明第二方面的引物組或本發(fā)明第三方面的試劑盒進(jìn)行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物；對pcr擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，確定待測禾花鯉的基因組中本發(fā)明第一方面的snp分子標(biāo)記的基因。

26、在本發(fā)明一些實施方式中，當(dāng)所述snp位點的基因型為aa，則為體重、全長和體長優(yōu)異的禾花鯉。

27、在本發(fā)明一些實施方式中，所述禾花鯉的dna可以采用本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)手段提取得到，包括酚氯仿法和各種dna提取試劑盒。

28、在本發(fā)明一些實施方式中，pcr擴增的反應(yīng)程序為90～94℃預(yù)變性3～6min；90～94℃變性30～35s，56～60℃退火30～35s，70～72℃延伸80～90s，30～35個循環(huán)；70～72℃延伸5～10min。

29、在本發(fā)明一些實施方式中，pcr擴增的反應(yīng)體系包括1～3mmol/lmgcl2、0.1～0.2mmol/l?dntp、0.05～0.1u/μl?taq酶，上下游引物各0.2～0.3μmol/l。

30、在本發(fā)明一些實施方式中，所述測序包括使用sanger法進(jìn)行測序。

31、本發(fā)明的第六個方面，提供本發(fā)明第五個方面的方法在選育生長優(yōu)異禾花鯉品種中的應(yīng)用。

32、本發(fā)明的有益效果是：

33、本發(fā)明提供一種禾花鯉的snp標(biāo)記(snp30621285)，通過檢測該snp標(biāo)記，能夠在相同養(yǎng)殖條件下有效地挑選生長性狀更好(體重更重、生長更快)的禾花鯉，能夠有效用于禾花鯉的分子標(biāo)記輔助育種。進(jìn)而能夠根據(jù)實際育種需求對禾花鯉親本進(jìn)行基因型鑒定，挑選合適的基因型禾花鯉親本進(jìn)行繁殖，可以獲得生長較快的禾花鯉后代(魚苗)，節(jié)約育種時間，成本低廉，準(zhǔn)確性高，加快禾花鯉育種進(jìn)程。

34、本發(fā)明所獲得的基因型是依據(jù)基因內(nèi)部產(chǎn)生的堿基突變，因此不存在遺傳的交換，也不需要表型的進(jìn)一步驗證。

技術(shù)特征：

1.與禾花鯉生長性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記，其特征在于，所述snp分子標(biāo)記的序列如seqid?no:1所示，snp位點位于seq?id?no:1所示序列自5’端起第1001位，其多態(tài)性為a/g。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的snp分子標(biāo)記，其特征在于，當(dāng)snp位點的基因型為gg，則禾花鯉的生長性狀為生長劣勢，當(dāng)snp位點的基因型為aa，禾花鯉的生長性狀為生長優(yōu)勢。

3.用于擴增權(quán)利要求1或2所述的snp分子標(biāo)記的引物組。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物組，其特征在于，所述引物組的核苷酸序列如下所示：f：5'-tcacatcatgctcccccaac-3'；

5.一種試劑盒，包括權(quán)利要求3或4所述的引物組。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括pcr中使用的緩沖液。

7.權(quán)利要求1或2所述的snp分子標(biāo)記、權(quán)利要求3或4所述的引物組和/或權(quán)利要求5或6所述的試劑盒在(1)～(4)中任一項中的應(yīng)用：

8.一種篩選禾花鯉生長快慢的方法，通過檢測待測禾花鯉的基因組中權(quán)利要求1或2所述的snp分子標(biāo)記的基因型，根據(jù)基因型確定所述待禾花鯉的生長快慢。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：以待測禾花鯉dna為模板，使用權(quán)利要求3或4所述的引物組或權(quán)利要求5或6所述的試劑盒進(jìn)行pcr擴增，得到pcr擴增產(chǎn)物；對pcr擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，確定待測禾花鯉的基因組中權(quán)利要求1或2所述的snp分子標(biāo)記的基因；

10.權(quán)利要求8或9所述的方法在選育生長優(yōu)異禾花鯉品種中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于動物分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，公開了與禾花鯉生長性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用，具體公開了與禾花鯉生長性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，所述SNP分子標(biāo)記的序列如SEQ?ID?NO:1所示，SNP位點位于SEQ?ID?NO:1所示序列自5’端起第1001位，其多態(tài)性為A/G。本發(fā)明提供一種禾花鯉的SNP標(biāo)記，通過檢測該SNP標(biāo)記，能夠在相同養(yǎng)殖條件下有效地挑選生長性狀更好的禾花鯉，能夠有效用于禾花鯉的分子標(biāo)記輔助育種。進(jìn)而能夠根據(jù)實際育種需求對禾花鯉親本進(jìn)行基因型鑒定，挑選合適的基因型禾花鯉親本進(jìn)行繁殖，可以獲得生長較快的禾花鯉后代(魚苗)，加快禾花鯉育種進(jìn)程。

技術(shù)研發(fā)人員：馬冬梅,朱華平,鐘再選,樊佳佳,田園園,林明輝
受保護的技術(shù)使用者：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/29