本發(fā)明涉及牙髓組織處理，特別涉及一種牙髓組織干細胞的分離制備方法及其牙髓組織清洗液。

背景技術：

1、牙髓干細胞是來源于牙髓組織的成體干細胞，屬于間充質(zhì)干細胞，具有分裂增殖、多向分化、再生修復、自我更新功能，其在疾病治療以及組織工程等領域中表現(xiàn)出重要的臨床價值和應用前景。

2、牙髓干細胞(dental?pulp?stem?cells，dpscs)作為一種間充質(zhì)干細胞，不僅具有與其他間充質(zhì)干細胞一樣的良好增殖分化能力和多向分化潛能，同時無胚胎干細胞的致瘤性，并且來源豐富，取材過程中避免了對人體的二次創(chuàng)傷和倫理法律問題。

3、然而，現(xiàn)有的牙髓干細胞分離方法存在許多不足。牙齒位于口腔中，而口腔中的細菌種類繁雜，牙髓干細胞在分離制備及培養(yǎng)過程中極易污染，從而導致牙髓干細胞分離制備困難。當前在牙髓干細胞的分離制備中使用的牙髓清洗液大都為生理鹽水或磷酸緩沖液，雖然配制簡便，但不能有效解決染菌問題，也有采用加入抗生素的方法實現(xiàn)，但染菌的情況仍無法完全解決，不利于之后的干細胞分離和獲取。

4、青霉素是抗菌素的一種，是指分子中含有青霉烷、能破壞細菌的細胞壁并在細菌細胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是由青霉菌中提煉出的抗生素。鏈霉素對許多革蘭陰性桿菌如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、腸桿菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、布魯菌屬、巴斯德桿菌屬等也具抗菌作用；腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌亦對本品敏感。鏈霉素對葡萄球菌屬及其他革蘭陽性球菌的作用差。各組鏈球菌、銅綠假單胞菌和厭氧菌對本品耐藥。

5、異噻唑啉酮主要由5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(cmi)和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(mi)組成。異噻唑啉酮是通過斷開細菌和藻類蛋白質(zhì)的鍵而起殺生作用的。異噻唑啉酮與微生物接觸后，能迅速地不可逆地抑制其生長，從而導致微生物細胞的死亡，故對常見細菌、真菌、藻類等具有很強的抑制和殺滅作用。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術的問題，本發(fā)明提供了一種牙髓組織干細胞的分離制備方法及其牙髓組織清洗液，其能夠降低牙髓干細胞分離制備過程染菌的風險，提高了牙髓干細胞的純度和獲得率。

2、本發(fā)明所采用的技術方案如下：

3、一種牙髓組織干細胞的分離制備方法，包括以下步驟：

4、a、牙齒的采集和保存：臨床收集正常的乳牙或恒牙待用；

5、b、消毒清洗：將所述的牙齒用0.02％乙酸氯己定溶液浸泡消毒5-6min，隨后將消毒后的牙齒用牙髓組織清洗液進行清洗；

6、c、分離：沿著牙釉質(zhì)和牙骨質(zhì)分界處用高速牙科手機環(huán)繞牙頸部磨出凹槽，不可穿髓，在超凈化工作臺中，沿凹槽劈開牙齒，取出牙冠根部的全部牙髓，并切除牙齒根尖部1mm的牙髓，將得到的牙髓用所述的牙髓組織清洗液清洗3-5次，將上述全部牙髓組織剪成1mm3～3mm3大小的牙髓塊用以進行原代細胞培養(yǎng)；

7、d、消化：將所述的牙髓塊移入牙髓干細胞組織消化液中，混勻后37℃消化15min，加入完全培養(yǎng)基終止消化后，離心，棄上清，將沉淀移入已加完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37℃、5％?co2恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后觀察到細胞貼壁，每3d換液一次，2周左右待細胞爬滿瓶底，約3-4d可傳代1次，所述的組織消化液含有1:1比例混合的3mg/ml的ⅰ型膠原酶(collagenase?typeⅰ)及4mg/ml分散酶(dispase)；

8、e、細胞傳代：細胞融合度達80％～90％時，進行細胞消化棄掉培養(yǎng)瓶中的上清液，用生理鹽水沖洗培養(yǎng)瓶底細胞，用0.25％try-edta的消化液消化細胞，待細胞由長梭形逐漸變圓并飄起時用新的無血清完全培養(yǎng)基終止消化；收集細胞并使之混勻，取樣計數(shù)后離心；用無血清培養(yǎng)基重懸后并進行接種，培養(yǎng)3～4d時細胞融合度80％～90％進行細胞收獲，經(jīng)多次傳代后即獲得p1、p2、p3.......代細胞；收集第3-5代細胞可用于后續(xù)實驗。

9、牙髓組織清洗液包括：生理鹽水：100ml；青霉素：14mg～20mg；鏈霉素：14mg～20mg；異噻唑啉酮：8mg～10mg。

10、牙髓組織清洗液的制備方法包括：

11、(1)將青霉素，鏈霉素，異噻唑啉酮按照比例溶于生理鹽水中，得到一份清洗液；

12、(2)將每份清洗液用125ml儲液瓶分裝，每瓶儲液瓶存儲100ml清洗液，之后擰緊瓶蓋，用封口膜進行封口，裝入自封袋后，再裝入真空封口袋中，進行真空封口。、步驟(2)中，將所述的清洗液使用0.22μm濾器過濾得到過濾液；然后將過濾液稀釋至1000ml得到二次清洗液；最后進行分裝，每瓶100ml，分裝、真空封口并低溫保存。

13、步驟(1)(2)均需在無菌環(huán)境中操作。

14、本發(fā)明提供的技術方案帶來的有益效果是：

15、(1)本發(fā)明所述的清洗液中加入了異噻唑啉酮、鏈霉素以及青霉素，對常見細菌、真菌、藻類等具有很強的抑制和殺滅作用，可針對性的防止臍帶組織在清洗過程中被微生物感染，相對于普通的生理鹽水沖洗，具有更好的抗菌效果。

16、(2)本發(fā)明使用生理鹽水為基礎，加入了各種抗生素，通過控制各個成分的含量，可以在沖洗過程中，保證牙髓組織不被微生物感染的前提下，維持牙髓組織的形態(tài)結構和生物活性，延長牙髓組織的保存時間，提高牙髓組織干細胞的得率。

17、(3)本發(fā)明提供的牙髓干細胞的分離制備方法中，通過對牙齒消毒清洗方法的調(diào)整，使用膠原酶和中性蛋白酶對牙髓組織進行消化，能夠有效降低牙髓干細胞分離制備過程中被污染的風險，有利于促進牙髓干細胞的爬出，提高牙髓干細胞的純度和獲得率，有利于后續(xù)牙髓干細胞培養(yǎng)過程中的增殖，為工業(yè)上高效分離制備牙髓干細胞提供了理論指導。

技術特征：

1.一種牙髓組織干細胞的分離制備方法，包括以下步驟：

2.一種根據(jù)權利要求1所述的一種牙髓組織干細胞的分離制備方法中的牙髓組織清洗液，其特征在于，包括：生理鹽水：100ml；青霉素：14mg～20mg；鏈霉素：14mg～20mg；異噻唑啉酮：8mg～10mg。

3.根據(jù)權利要求2所述的一種牙髓組織干細胞的分離制備方法，其特征在于，所述的牙髓組織清洗液的制備方法包括：

4.根據(jù)權利要求3所述的一種牙髓組織干細胞的分離制備方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，將所述的清洗液使用0.22μm濾器過濾得到過濾液；然后將過濾液稀釋至1000ml得到二次清洗液；最后進行分裝，每瓶100ml，分裝、真空封口并低溫保存。

5.根據(jù)權利要求3或4所述的一種牙髓組織干細胞的分離制備方法，其特征在于，所述的步驟(1)(2)均需在無菌環(huán)境中操作。

技術總結
本發(fā)明涉及牙髓組織處理技術領域，特別涉及一種牙髓組織干細胞的分離制備方法及其牙髓組織清洗液。本發(fā)明提供的一種牙髓組織干細胞的分離制備方法及其牙髓組織清洗液，通過在分離制備過程中使用牙髓組織清洗液，從而降低了牙髓干細胞分離制備過程染菌的風險，提高了牙髓干細胞的純度和獲得率。

技術研發(fā)人員：趙丹丹,張百峰,李盼,段瑞雪,羅廣震,李芬,李世香,李晶晶,馬雪嬌,田艷玲
受保護的技術使用者：山東水發(fā)生命科學研究有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/9/29