本發(fā)明涉及血液制品，具體涉及一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝。

背景技術：

1、人凝血因子ⅷ（human?coagulation?factor?ⅷ）是人血漿中一種重要的蛋白質(zhì)，是人體內(nèi)源性凝血途徑的主要成分，人凝血因子ⅷ對缺乏人凝血因子ⅷ所致的凝血機能障礙具有糾正作用，主要用于防治甲型血友病和獲得性凝血因子ⅷ缺乏而致的出血癥狀及這類病人的手術出血治療。隨著技術的日趨發(fā)展，層析技術已成熟應用于人凝血因子ⅷ的分離制備，特別是離子交換層析法，因其制備的人凝血因子ⅷ具有純度較高，重現(xiàn)性好，成本相對較低的優(yōu)點，為國內(nèi)外大多數(shù)廠家所采用。

2、《中國藥典》2015版規(guī)定人凝血因子ⅷ的比活性為每1mg蛋白質(zhì)應不低于10.0iu，但人凝血因子ⅷ分子量大、結(jié)構(gòu)復雜，易失活，因此規(guī)模化生產(chǎn)的人凝血因子ⅷ的比活性一般會比規(guī)定的高。而比活性高的人凝血因子ⅷ，在疾病治療中發(fā)揮著巨大的作用。

3、常用的離子交換層析法純化工藝路線為平衡-上樣-洗滌-洗脫，按照該工藝路線進行試驗，經(jīng)單步洗滌層析工藝純化，洗脫后人凝血因子ⅷ的效價回收率和比活性均不高，而當對常規(guī)層析工藝進行優(yōu)化時，效價回收率和比活性往往存在此消彼長的問題，如果能將效價回收率和比活性同時提高，則極大降低了人凝血因子ⅷ商業(yè)化生產(chǎn)的難度和成本，提升血漿的綜合利用率。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術中難以同時提高人凝血因子ⅷ效價回收率和比活性的技術問題，本發(fā)明提供一種適用于商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化方法，得到的人凝血因子ⅷ具有比活性高、效價回收率高、工藝簡單、適于商業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。

2、本發(fā)明技術方案如下：

3、一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，步驟包括層析柱平衡、層析柱上樣、層析柱洗滌和層析柱洗脫，層析柱洗滌時先后采用洗滌液a、洗滌液b進行兩步梯度洗滌，洗滌液a包括枸櫞酸鈉10～20mmol/l、氯化鈉120～140mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化鈣1～3mmol/l，洗滌液b包括枸櫞酸鈉10～20mmol/l、氯化鈉140～180mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化鈣1～3mmol/l，洗滌液a、洗滌液b的ph均為7.00±0.50，層析柱填料為toyopearl?deae-650m陰離子交換凝膠。

4、進一步的，洗滌液a包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉120mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液b包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液a、洗滌液b的ph均為7.00。

5、進一步的，洗滌液a包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉130mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液b包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液a、洗滌液b的ph均為7.00。

6、進一步的，洗滌液a包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉140mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液b包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液a、洗滌液b的ph均為7.00。

7、進一步的，層析柱平衡時使用ph為7.00±0.50的平衡液。

8、進一步的，平衡液包括枸櫞酸鈉10～20mmol/l、氯化鈉80～120mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化鈣1～3mmol/l。

9、進一步的，平衡液包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉80mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，平衡液ph為7.00。

10、進一步的，s/d病毒滅活后制品調(diào)整電導率與平衡液一致后進行層析柱上樣。

11、s/d病毒滅活后制品上樣前調(diào)整電導率與平衡液一致可以減少上樣前s/d病毒滅活后制品的電導率波動，增大人凝血因子ⅷ和雜蛋白吸附能力差異，使大多數(shù)雜蛋白無法被吸附，而人凝血因子ⅷ蛋白恰能被吸附，更有利于分離純化。

12、進一步的，層析柱洗脫時使用ph為7.00±0.50的洗脫液，洗脫液包括枸櫞酸鈉10～20mmol/l、氯化鈉1～2mol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化鈣1～3mmol/l。

13、進一步的，洗脫液包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉1mol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗脫液ph為7.00。

14、本發(fā)明的有益效果在于：

15、本發(fā)明提供的一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，在常規(guī)層析技術基礎上，將單步洗滌優(yōu)化為兩步梯度洗滌，兩步梯度洗滌的氯化鈉濃度分別選擇在一個合適的范圍內(nèi)，洗滌a的氯化鈉濃度低，與s/d病毒滅活后制品濃度相當，采用洗滌液a洗滌后，可有效洗滌掉一些結(jié)合不牢固的雜蛋白，而不影響人凝血因子ⅷ，采用洗滌液b洗滌后，由于氯化鈉濃度的適當提高，可在人凝血因子ⅷ效價的損失較少的前提下進一步洗滌掉部分結(jié)合較為牢固的雜蛋白，既能夠滿足去除雜蛋白的需求，又能盡量避免人凝血因子ⅷ的損失，實現(xiàn)了效價回收率和比活性的同時提高，對人凝血因子ⅷ的商業(yè)化生產(chǎn)有非常積極的影響，且在多次平行試驗中發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明受凝膠批次差異的影響較小，工藝表現(xiàn)穩(wěn)定。

技術特征：

1.?一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，其特征在于，步驟包括層析柱平衡、層析柱上樣、層析柱洗滌和層析柱洗脫，層析柱洗滌時先后采用洗滌液a、洗滌液b進行兩步梯度洗滌，洗滌液a包括枸櫞酸鈉10～20mmol/l、氯化鈉120～140mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化鈣1～3mmol/l，洗滌液b包括枸櫞酸鈉10～20mmol/l、氯化鈉140～180mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化鈣1～3mmol/l，洗滌液a、洗滌液b的ph均為7.00±0.50，層析柱填料為toyopearl?deae-650m陰離子交換凝膠。

2.如權利要求1所述的一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，其特征在于，洗滌液a包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉120mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液b包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液a、洗滌液b的ph均為7.00。

3.如權利要求1所述的一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，其特征在于，洗滌液a包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉130mol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液b包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液a、洗滌液b的ph均為7.00。

4.如權利要求1所述的一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，其特征在于，洗滌液a包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉140mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液b包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉160mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗滌液a、洗滌液b的ph均為7.00。

5.如權利要求1所述的一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，其特征在于，層析柱平衡時使用ph為7.00±0.50的平衡液。

6.如權利要求5所述的一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，其特征在于，平衡液包括枸櫞酸鈉10～20mmol/l、氯化鈉80～120mmol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化鈣1～3mmol/l。

7.如權利要求6所述的一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，其特征在于，平衡液包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉80mmol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，平衡液ph為7.00。

8.如權利要求1所述的一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，其特征在于，s/d病毒滅活后制品調(diào)整電導率與平衡液一致后進行層析柱上樣。

9.如權利要求1所述的一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，其特征在于，層析柱洗脫時使用ph為7.00±0.50的洗脫液，洗脫液包括枸櫞酸鈉10～20mmol/l、氯化鈉1～2mol/l、甘氨酸120～150mmol/l和氯化鈣1～3mmol/l。

10.如權利要求9所述的一種生產(chǎn)人凝血因子ⅷ的層析純化工藝，其特征在于，洗脫液包括枸櫞酸鈉10mmol/l、氯化鈉1mol/l、甘氨酸120mmol/l和氯化鈣1mmol/l，洗脫液ph為7.00。

技術總結(jié)
本發(fā)明涉及血液制品技術領域，具體涉及一種生產(chǎn)人凝血因子Ⅷ的層析純化工藝，步驟包括層析柱洗滌，層析柱洗滌時先后采用洗滌液A、洗滌液B進行兩步梯度洗滌，洗滌液A包括枸櫞酸鈉10～20mmol/L、氯化鈉120～140mmol/L、甘氨酸120～150mmol/L和氯化鈣1～3mmol/L，洗滌液B包括枸櫞酸鈉10～20mmol/L、氯化鈉140～180mmol/L、甘氨酸120～150mmol/L和氯化鈣1～3mmol/L，洗滌液A、洗滌液B的pH均為7.00±0.50，層析柱填料為Toyopearl?DEAE?650M陰離子交換凝膠，得到的人凝血因子Ⅷ比活性高、效價回收率高。

技術研發(fā)人員：孫豐斌,張興魁,師秀梅,張國棟,王健,候緒剛,陳政,喬福鋒,鄭志華
受保護的技術使用者：山東泰邦生物制品有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/9/29