本發(fā)明涉及一種d-蘇氨酸醛縮酶，尤其涉及一種高立體選擇性的d-蘇氨酸醛縮酶突變體及其應用，屬于酶工程和化學工程。

背景技術：

1、通過形成碳碳鍵(c-c)，作為生物催化劑的縮酶能夠將碳骨架延長，形成更大的分子，而酶促醛醇加成反應可在綠色條件下生成許多高價值化合物，因此在自然界的有機物循環(huán)中起關鍵作用。蘇氨酸醛縮酶(threonine?aldolase，ta)，包括d-蘇氨酸醛縮酶(dta)和l-蘇氨酸醛縮酶，能夠在磷酸吡哆醛的輔助下催化不同類型的醛與氨基酸縮合形成β-羥基-α-氨基酸，為活性藥物成分、抗生素或農(nóng)用化學品構件等各種高價值化合物提供了多功能催化平臺。β-羥基-α-氨基酸含有雙手性中心(cα和cβ)，而目前已報道的ta同時生成非對映異構體threo-β-羥基-α-氨基酸和erythro-β-羥基-α-氨基酸，即在cα具有高度立體選擇性，但普遍不能嚴格控制cβ立體選擇性，導致產(chǎn)物的非對映體過量值(diastereomericexcess，de)較低。有報道使用來自a.xylosoxidans來源的d-low-ta，能實現(xiàn)以4-甲砜基苯甲醛的催化反應的產(chǎn)率提升，但未提及cβ位點的非對映選擇性。

技術實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種在制備d-thero對甲砜基苯絲氨酸時具備更高活性和更高立體選擇性的d-蘇氨酸醛縮酶突變體及其應用。

2、技術方案：本發(fā)明的第一方面提供一種高立體選擇性的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，所述d-蘇氨酸醛縮酶突變體的氨基酸序列由如seq?id?no:1所示序列經(jīng)突變得到，所述突變包括：第146位天冬酰胺變?yōu)楦拾彼?、賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺中的任意一種，和/或第147位精氨酸突變?yōu)楸奖彼帷⒗野彼嶂械娜我庖环N，和/或第148位半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?或第177位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?、組氨酸、色氨酸中的任意一種，和/或第312位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、亮氨酸、蘇氨酸中的任意一種。

3、優(yōu)選s312a、y177f/s312a、r147f/y177f/s312a、c148f/r147f/y177f/s312a、n146g/r147f/y177f/s312a、n146k/r147f/y177f/s312a中的任意一種。

4、本發(fā)明利用公開的d-蘇氨酸醛縮酶的序列和結構信息，通過在ncbi等數(shù)據(jù)庫中進行非冗余性檢索，根據(jù)蛋白結構相似性、保守位點分析和宿主來源多樣性等原則，篩選出潛在的酶基因；將這些基因進行功能表達、純化，得到純凈的酶。優(yōu)選的d-蘇氨酸醛縮酶(seqid?no:1，ncbi登錄號wp_046479359.1)源自海洋單胞菌filomicrobiummarinum，其具備廣泛的底物適用性，能夠催化多種醛和α氨基酸底物生成對應的β-羥基-α-氨基酸化合物。本發(fā)明通過擴增該酶基因(seq?id?no:2)，并運用理性設計對其進行定向進化改造，最終獲得了多種對d-threo對甲砜基苯絲氨酸的非對映選擇性顯著提高的蘇氨酸醛縮酶突變體。

5、在本文的所有討論中，使用針對氨基酸的標準單字母代碼，以及標準的取代記法。例如，s312a意指n端處第312位的絲氨酸(s)突變?yōu)楸彼?a)；y177f/s312a意指n端處第177位的酪氨酸(y)突變?yōu)楸奖彼?f)，并且n端處第312位的絲氨酸(s)突變?yōu)楸彼?a)。

6、本發(fā)明的第二方面提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼如第一方面所述的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，所述核酸分子的核苷酸序列由如seq?id?no:2所示序列經(jīng)堿基突變得到。

7、本發(fā)明的第三方面提供一種表達載體，所述表達載體包含如第二方面所述的核苷酸序列，所述表達載體可以為pet系列表達載體。

8、本發(fā)明的第四方面提供一種重組細胞及其構建方法，所述重組細胞包含如第三方面所述的表達載體，所述重組細胞可以為大腸桿菌。所述重組細胞的構建方法包括如下步驟：

9、(1)構建表達載體：將如第二方面所述的核酸分子與質(zhì)粒連接，得到如第三方面所述的表達載體；

10、(2)構建重組細胞：將構建好的表達載體轉入感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)并篩選得到重組細胞。

11、本發(fā)明的第五方面提供一種產(chǎn)品及其應用，所述產(chǎn)品包含如第一方面所述的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，或如第二方面所述的核酸分子，或如第三方面所述的表達載體，或如第四方面所述的重組細胞。所述產(chǎn)品包括催化劑。

12、所述應用包括合成d-thero對甲砜基苯絲氨酸，如催化醛和甘氨酸合成手性d-thero對甲砜基苯絲氨酸。

13、所述應用的反應條件包括在溫度為25～45℃，ph為5.5～10.0的條件下反應10～20h。所述應用的反應條件包括添加不超過總體積20％的有機溶劑。所述有機溶劑可選dmso。

14、有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點：1、本發(fā)明提供的所述突變體，具有較高的cβ立體選擇性和產(chǎn)率；2、本發(fā)明提供了一種制備d-thero對甲砜基苯絲氨酸的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含具有較高的cβ立體選擇性和產(chǎn)率的d-蘇氨酸醛縮酶突變體或其編碼基因或相應表達載體或相應重組細胞；3、本發(fā)明提供了一種d-蘇氨酸醛縮酶突變體的構建及其應用方法，所述應用的反應條件溫和、易于實現(xiàn)，在醫(yī)藥化工領域具有良好的應用前景。

技術特征：

1.一種高立體選擇性的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，其特征在于，所述d-蘇氨酸醛縮酶突變體的氨基酸序列由如seq?id?no:1所示序列經(jīng)突變得到，所述突變包括：第146位天冬酰胺變?yōu)楦拾彼?、賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺中的任意一種，和/或第147位精氨酸突變?yōu)楸奖彼?、酪氨酸中的任意一種，和/或第148位半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?或第177位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?、組氨酸、色氨酸中的任意一種，和/或第312位絲氨酸突變?yōu)楸彼帷⒘涟彼?、蘇氨酸中的任意一種。

2.根據(jù)權利要求1所述的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，其特征在于，所述突變體為s312a、y177f/s312a、r147f/y177f/s312a、c148f/r147f/y177f/s312a、n146g/r147f/y177f/s312a、n146k/r147f/y177f/s312a中的任意一種。

3.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子編碼權利要求1所述的d-蘇氨酸醛縮酶突變體。

4.根據(jù)權利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列由如seqid?no:2所示序列經(jīng)堿基突變得到。

5.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體包含權利要求4所述的核苷酸序列。

6.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞包含權利要求5所述的表達載體。

7.一種權利要求6所述重組細胞的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

8.一種產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包含權利要求1所述的d-蘇氨酸醛縮酶突變體，或權利要求3～4任一項所述的核酸分子，或權利要求5所述的表達載體，或權利要求6所述的重組細胞。

9.一種權利要求8所述產(chǎn)品在合成d-thero對甲砜基苯絲氨酸中的應用。

10.根據(jù)權利要求9所述的應用，其特征在于，所述應用的反應條件包括在溫度為25～45?℃，ph為5.5～10.0的條件下反應10~20?h。

技術總結
本發(fā)明公開了一種高立體選擇性的D?蘇氨酸醛縮酶突變體及其應用，所述突變體由野生型D?蘇氨酸醛縮酶定向進化得到，包括第146位天冬酰胺變?yōu)楦拾彼帷①嚢彼?、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺中的任意一種，和/或第147位精氨酸突變?yōu)楸奖彼?、酪氨酸中的任意一種，和/或第148位半胱氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?或第177位酪氨酸突變?yōu)楸奖彼帷⒔M氨酸、色氨酸中的任意一種，和/或第312位絲氨酸突變?yōu)楸彼?、亮氨酸、蘇氨酸中的任意一種。本發(fā)明提供的D?蘇氨酸醛縮酶突變體在合成D?thero對甲砜基苯絲氨酸時具有較高的C<subgt;β</subgt;立體選擇性和產(chǎn)率；應用所述突變體的反應條件溫和、易于實現(xiàn)，在醫(yī)藥化工領域具有良好的應用前景。

技術研發(fā)人員：任鑫坤,曹家南,王騫,余克洋,范鑫龍
受保護的技術使用者：南京大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/10/21