本發(fā)明涉及mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，oa)是一種軟骨細胞或基質(zhì)受損、丟失的退行性骨關(guān)節(jié)病，促進關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)再生是治療oa的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的oa治療方式包括物理治療、藥物治療以及手術(shù)治療，這些治療方式都不能根治oa。新興的間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，mscs)療法因其血管阻塞、免疫排斥和致瘤性等問題，限制了其在oa治療中的應(yīng)用。mscs療法在軟骨修復(fù)中的作用被證明是依靠旁分泌所產(chǎn)生的外泌體(exosomes，exos)發(fā)揮的。因此，外泌體的研究對mscs治療oa具有重要意義。

2、鹿茸干細胞是鹿茸快速生長的關(guān)鍵細胞。鹿茸干細胞被證實具有mscs特征，其通過增殖形成鹿茸的間充質(zhì)層，并且分化成軟骨細胞后又組成鹿茸的軟骨層，鹿茸干細胞不斷自我更新補充軟骨細胞，維持鹿茸的快速生長而不引起癌變。鹿茸干細胞克服了以往mscs腫瘤趨向性、傳代次數(shù)有限、細胞表型不一等問題，在軟骨修復(fù)過程中有著重要研究意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法，按以下步驟進行：一、mir-140慢病毒載體感染鹿茸干細胞：向培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基，然后按照2×105cell/ml的密度加入鹿茸干細胞，37℃，5％co2恒溫培養(yǎng)箱中孵育，待培養(yǎng)至細胞融合度為30-40％后進行轉(zhuǎn)染；棄培養(yǎng)基，然后加入dmem洗滌細胞，在moi值為30的條件下加入轉(zhuǎn)染液2.5ml，培養(yǎng)24h，再加入2.5ml轉(zhuǎn)染液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后q-pcr檢測轉(zhuǎn)染成功后即完成轉(zhuǎn)染；

3、二、鹿茸干細胞外泌體的分離：將轉(zhuǎn)染成功的鹿茸干細胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細胞融合度為60％-70％時，棄掉培養(yǎng)基，更換無外泌體血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度為90％，然后收集上清進行第一次離心，離心后收取上清液進行第二次離心，再收集上清液進行第三次離心，收集上清液進行過濾，再進行第四次離心，收取沉淀，即為mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體。

4、本發(fā)明的mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體在制備治療關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。

5、所述mir-140的核苷酸序列為：5’-uaccacaggguagaaccacgga-3’，moi為感染復(fù)數(shù)(multiplicity?ofinfection)。

6、本發(fā)明采用mirna抑制物(anti-mir-140)或類似物(mir-140)對mir-140的表達進行下調(diào)或上調(diào)，以nc-mir-140作為對照，將攜帶有mir-140、anti-mir-140、nc-mir-140的慢病毒分別轉(zhuǎn)染鹿茸干細胞后進行篩選，得到穩(wěn)定低表達或高表達mir-140的鹿茸干細胞系，超速梯度離心純化收集鹿茸干細胞外泌體，使用不同修飾的鹿茸干細胞外泌體治療oa軟骨細胞，結(jié)果顯示mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體促進了oa軟骨細胞的增殖、遷移，抑制了凋亡和炎癥作用，anti-mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體抑制了oa軟骨細胞的增殖、遷移，促進了凋亡和炎癥作用；進一步利用oa大鼠模型評價mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體對軟骨損傷修復(fù)的水平，結(jié)果顯示mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體促進軟骨組織的損傷修復(fù)，anti-mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體抑制軟骨組織的損傷修復(fù)。

7、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點：

8、體外：與未經(jīng)修飾的鹿茸干細胞外泌體相比，轉(zhuǎn)染mir-140的鹿茸干細胞外泌體處理oa軟骨細胞后可促進細胞的增殖、遷移，抑制凋亡和炎癥作用；同時，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上，軟骨形成標志基因colⅱ的表達量顯著增加，軟骨肥大化標志基因coli和colⅹ的表達量顯著降低。上述結(jié)果說明轉(zhuǎn)染mir-140的鹿茸干細胞外泌體促進oa軟骨細胞的成軟骨分化能力顯著提升。

9、體內(nèi)：與未經(jīng)修飾的鹿茸干細胞外泌體相比，轉(zhuǎn)染mir-140的鹿茸干細胞外泌體治療oa大鼠后，mankin和oarsi評分最低；軟骨形成標志基因colⅱ的表達量顯著增加，軟骨肥大化標志基因colⅹ和coli的表達量顯著降低；炎癥因子nlrp3的表達量顯著降低。上述結(jié)果說明轉(zhuǎn)染mir-140的鹿茸干細胞外泌體顯著促進軟骨組織的損傷修復(fù)及炎癥的抑制。

技術(shù)特征：

1.mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法，其特征在于該制備方法按以下步驟進行：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法，其特征在于步驟一中加入轉(zhuǎn)染液后的培養(yǎng)均在37℃，5％co2恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法，其特征在于完全培養(yǎng)基的配方為：90％dmem+10％血清+1％雙抗。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法，其特征在于無外泌體血清培養(yǎng)基的配方為：90％dmem+10％無外泌體血清+1％雙抗。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法，其特征在于第一次離心是在4℃條件下，300×g離心15min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法，其特征在于第二次離心是在4℃條件下，2000×g離心30min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法，其特征在于第三次離心是在4℃條件下，10000×g離心30min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法，其特征在于第三次離心后的上清液采用0.22μm的無菌濾膜過濾。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法，其特征在于第四次離心是在4℃條件下，120000×g離心2h。

10.如權(quán)利要求1所述mir-140修飾的鹿茸干細胞外泌體在制備治療關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
miR?140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明涉及miR?140修飾的鹿茸干細胞外泌體的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明采用miR?140對miR?140的表達進行上調(diào)，將攜帶有miR?140的慢病毒轉(zhuǎn)染鹿茸干細胞后，得到穩(wěn)定高表達miR?140的鹿茸干細胞系，超速梯度離心純化收集鹿茸干細胞外泌體，使用鹿茸干細胞外泌體治療OA軟骨細胞，結(jié)果顯示miR?140修飾的鹿茸干細胞外泌體促進了OA軟骨細胞的增殖、遷移，抑制了凋亡和炎癥作用；進一步利用OA大鼠模型評價miR?140修飾的鹿茸干細胞外泌體對軟骨損傷修復(fù)的水平，結(jié)果顯示可以促進軟骨組織的損傷修復(fù)。本發(fā)明應(yīng)用于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)研發(fā)人員：賈博寅,王雪,顏辛芮,張俁,劉威,劉暢,杜銳,李鑫,韓欣桐,王玉俗
受保護的技術(shù)使用者：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/29