本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種pp2a和eif5a作為不同水飛薊組織熒光定量內(nèi)參基因的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水飛薊(silybum?marianum(l.)gaertn.)又名水飛雉、奶薊等，屬于菊科水飛薊屬草本植物，入藥部位為種子(果實(shí))，是多國藥典收載的天然藥物，臨床上主要用于治療肝炎、脂肪肝、肝硬化、缺血性損傷、輻射損傷等。水飛薊素為菊科植物水飛薊的果實(shí)或種子的總提取物，含65％-80％黃酮木脂素(或稱水飛薊素混合物)，20％-35％脂肪酸，少量黃酮和一些多酚，其有效成分為黃酮木脂素類化合物，由水飛薊賓、水飛薊亭、水飛薊寧等成分組成。

2、水飛薊賓是水飛薊素中含量最高的成分，系由一分子的黃杉素(toxifolin)和一分子的松柏醇(coniferylalcohol)耦合而成，屬于類黃酮(flavonoid)物質(zhì)中的異黃酮類(isoflavone)。目前雖然對(duì)于水飛薊賓的純化方法、化學(xué)性質(zhì)及生理活性等已經(jīng)進(jìn)行了大量而深入的研究，但關(guān)于于水飛薊賓的生物合成途徑及調(diào)控機(jī)理的研究卻十分有限。

3、內(nèi)參基因的高穩(wěn)定性有助于基因表達(dá)數(shù)據(jù)的可靠性。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在不同的組織器官、不同的生長發(fā)育期等條件下均能表現(xiàn)穩(wěn)定的表達(dá)趨勢。篩選合適的內(nèi)參基因是獲得可靠qrt-pcr分析結(jié)果的前提。目前還未有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)對(duì)于水飛薊果實(shí)不同發(fā)育期及不同組織內(nèi)參基因的篩選。

4、qrt-pcr是對(duì)dna、rna(mrna、mirna與non-coding?rna)樣品進(jìn)行定量和定性分析的一項(xiàng)重要技術(shù)。其中，相對(duì)定量法利用內(nèi)參基因的表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)能簡單、準(zhǔn)確且高效地檢測目的基因的相對(duì)表達(dá)量。物種的差異決定了基因在不同物種中的表達(dá)趨勢具有差異性，同一物種不同組織器官及不同發(fā)育階段中相同基因的表達(dá)也存在差異。理想情況下，內(nèi)參基因的表達(dá)水平不受任何內(nèi)源或外源性因素的影響。迄今為止，尚未有研究發(fā)現(xiàn)普遍適用于所有條件的理想內(nèi)參基因。因此，針對(duì)不同物種的不同實(shí)驗(yàn)所研究的不同組織、基因型、發(fā)育階段和處理?xiàng)l件，都需要尋找適合其實(shí)驗(yàn)體系的內(nèi)參基因。

5、因此，對(duì)水飛薊的穩(wěn)定內(nèi)參基因及其引物的開發(fā)，在水飛薊分子生物學(xué)研究及其藥效成分生物合成的研究中皆具有重要實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種pp2a和eif5a作為不同水飛薊組織熒光定量內(nèi)參基因的應(yīng)用，為水飛薊不同組織條件下的相關(guān)功能基因的表達(dá)定量提供可靠的分析依據(jù)，為功能基因的挖掘奠定必要的前期基礎(chǔ)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了pp2a和eif5a作為不同水飛薊組織熒光定量內(nèi)參基因的應(yīng)用。

4、優(yōu)選的，擴(kuò)增所述pp2a基因的上游引物如seq?id?no.1所示，上游引物序列如seqid?no.2所示；擴(kuò)增所述eif5a基因的上游引物如seq?id?no.3所示，上游引物序列如seq?idno.4所示。

5、優(yōu)選的，所述不同水飛薊組織為水飛薊的莖、葉、花和不同發(fā)育期果實(shí)

6、本發(fā)明還提供了一種不同水飛薊組織熒光定量內(nèi)參基因的篩選方法，包括如下步驟：

7、(1)取水飛薊植株上的莖、葉、花和不同發(fā)育期的果實(shí)，液氮冷凍，并提取總rna；

8、(2)將步驟(1)提取的總rna反轉(zhuǎn)錄得到cdna；

9、(3)使用9個(gè)候選rg的引物制作各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算對(duì)應(yīng)引物的擴(kuò)增效率、每個(gè)基因ct均值，然后使用9個(gè)候選rg的引物進(jìn)行qrt-pcr擴(kuò)增，并檢測9個(gè)候選rg的擴(kuò)增效率、ct均值及每對(duì)引物的相關(guān)系數(shù)；

10、(4)根據(jù)得到的擴(kuò)增效率、ct均值及每對(duì)引物的相關(guān)系數(shù)，利用δct、genorm、normfinder、bestkeeper四種統(tǒng)計(jì)分析方法，分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性；最后利用reffinder工具對(duì)所有內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行綜合排序，篩選出最適合的內(nèi)參基因。

11、優(yōu)選的，所述9個(gè)候選rg分別為：18s、ubq2、tua5、adf、elf5a-1、pp2a、mir172a、mir319a、mir396。

12、本發(fā)明還提供了一種檢測水飛薊藥效成分生物合成情況的熒光定量pcr檢測方法，包括如下步驟：

13、(1)取水飛薊植株上的莖、葉、花和不同發(fā)育期的果實(shí)，液氮冷凍，并提取總rna；

14、(2)將步驟(1)提取的總rna反轉(zhuǎn)錄得到cdna；

15、(3)使用擴(kuò)增pp2a和eif5a內(nèi)參基因的引物seq?id?no.1～seq?id?no.4擴(kuò)增步驟(2)得到的cdna，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析得到水飛薊果實(shí)發(fā)育階段藥效成分生物合成情況。

16、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果為：

17、(1)本發(fā)明通過4種算法(genorm、normfinder、bestkeeper和reffinder)評(píng)估候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，獲得了適用于水飛薊不同組織和果實(shí)不同發(fā)育期的熒光定量內(nèi)參基因pp2a和eif5a；

18、(2)本發(fā)明設(shè)計(jì)了內(nèi)參基因pp2a和eif5a的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物，該引物特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效率高，為水飛薊不同組織條件下的相關(guān)功能基因的表達(dá)定量提供可靠的分析依據(jù)，為功能基因的挖掘奠定必要的前期基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.pp2a和eif5a作為不同水飛薊組織熒光定量內(nèi)參基因的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述pp2a和eif5a作為不同水飛薊組織熒光定量內(nèi)參基因的應(yīng)用，其特征在于，擴(kuò)增所述pp2a基因的上游引物如seq?id?no.1所示，下游引物序列如seq?idno.2所示；擴(kuò)增所述eif5a基因的上游引物如seq?id?no.3所示，下游引物序列如seq?idno.4所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述pp2a和eif5a作為不同水飛薊組織熒光定量內(nèi)參基因的應(yīng)用，其特征在于，所述不同水飛薊組織為水飛薊的莖、葉、花和不同發(fā)育期果實(shí)。

4.一種不同水飛薊組織熒光定量內(nèi)參基因的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述不同水飛薊組織熒光定量內(nèi)參基因的篩選方法，其特征在于，所述9個(gè)候選rg分別為：18s、ubq2、tua5、adf、elf5a、pp2a、mir172a、mir319a、mir396。

6.一種檢測水飛薊藥效成分生物合成情況的熒光定量pcr檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種PP2A和EIF5A作為不同水飛薊組織熒光定量內(nèi)參基因的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder這4種算法評(píng)估候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，獲得了適用于水飛薊不同組織和果實(shí)不同發(fā)育期的熒光定量內(nèi)參基因PP2A和EIF5A。本發(fā)明設(shè)計(jì)了內(nèi)參基因PP2A和EIF5A的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，該引物特異性強(qiáng)，擴(kuò)增效率高，為水飛薊不同組織條件下的相關(guān)功能基因的表達(dá)定量提供可靠的分析依據(jù)，為功能基因的挖掘奠定必要的前期基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：嚴(yán)梓銣,何秋伶,趙予婕,徐伯衡
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江理工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/29