本發(fā)明屬于酶固定化，具體涉及一種fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法及其應用。

背景技術：

1、在界面反應中，脂肪酶可以參與油水兩相之間的反應。由于脂肪酶是一種水溶性酶，不易溶于油相中，因此主要活動在油水界面上。但脂肪酶也可以在兩相體系中參與反應，不一定完全局限于油水界面。但其在兩相體系中反應速率較慢，主要是由于在兩相界面降解脂肪酸的速率較快，導致脂肪酶不能迅速地降解更多的脂肪酸分子，從而影響整個反應速率。此外，在兩相體系中，脂肪酶降解過程中會生成酸性物質，這些物質可能會影響酶的穩(wěn)定性和活性，從而進一步影響脂肪酶的反應速率。

2、針對脂肪酶在兩相反應中的限速問題，不同的研究組采用了多種方法進行改進與探索，包括超聲輔助降解法、基因工程技術以及微乳液法等。超聲輔助降解法可以提高脂肪酶在油水界面上的催化效率，從而提高反應速率；但是該方法需要耗費大量的能量，并且受到基質溶液和反應條件的影響，可能存在部分降解酶的問題?；蚬こ碳夹g通過對脂肪酶的基因進行改造，設計出更高效的脂肪酶來提高其催化效率；但是該方法的復雜性較高，需要對脂肪酶進行基因編輯或人工合成操作，并且成本較高。微乳液法可以在水和油之間形成微乳液，使脂肪酶分散在界面上，從而提高了催化效率和反應速率；但該方法需要加入表面活性劑來穩(wěn)定微乳液，且表面活性劑可能影響反應的選擇性和酶的結構。目前，這些方法都存在一些限制性問題，如超聲輔助降解法耗能過大，基因工程技術操作復雜，微乳液法的表面活性劑可能影響催化效率等。

3、因此，亟需開發(fā)一種新的方法來提高脂肪酶在兩相體系中的催化效率，以解決脂肪酶在界面反應中的限速問題。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的缺陷，提供一種fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法及其應用。

2、為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術方案之一為：一種fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法，包括以下步驟：

3、(1)制備疏水性納米磁性顆粒fe3o4@phe：將fecl3·6h2o、fecl2·4h2o、無水乙醇按比例混合超聲，隨后加熱攪拌制得第一混合液；向第一混合液中加入氨水，加熱攪拌制得第二混合液；將第二混合液和苯丙氨酸溶液混合，加熱攪拌制得疏水性納米磁性顆粒fe3o4@phe溶液；

4、(2)制備生物復合物fe3o4@phe@脂肪酶：將步驟(1)制得的疏水性納米磁性顆粒fe3o4@phe溶液經磁分離后使用tris-hcl緩沖液振蕩洗滌固相得到fe3o4@phe；將所得fe3o4@phe和脂肪酶溶液旋轉混合，經磁分離后使用tris-hcl緩沖液振蕩洗滌固相得到fe3o4@phe@脂肪酶；

5、(3)3d打印fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球：將海藻酸鈉、中空微球粉末和tris-hcl緩沖液混合，再加熱攪拌至完全溶解得到第三混合液；待第三混合液冷卻后加入步驟(2)制得的fe3o4@phe@脂肪酶，充分混勻制成生物墨水；在3d打印機中裝載生物墨水，導入球狀顆粒的三維立體結構的模型進行打印塑狀，塑狀后的球狀顆粒放入cacl2溶液進行交聯(lián)固定，制備得到懸浮于油水界面的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球。

6、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(1)中fecl3·6h2o、fecl2·4h2o和無水乙醇的質量比為5.65:2.05:15～56.5:20.5:150，按照0.2-0.3g/ml的比例在第一混合液中加入氨水。

7、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(1)中苯丙氨酸溶液包括苯丙氨酸和氨水。

8、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(1)中苯丙氨酸溶液中苯丙氨酸濃度為0.25～1.0g/ml。

9、進一步優(yōu)選的，所述苯丙氨酸為l-苯丙氨酸。

10、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(1)中加熱攪拌制得第一混合液的溫度為60～70℃，時間為5～60min，加熱攪拌制得第二混合液的溫度為70～80℃，時間為5～60min，加熱攪拌制得疏水性納米磁性顆粒fe3o4@phe溶液的溫度為80～100℃，時間為5～120min。

11、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(2)和(3)中tris-hcl緩沖液的ph為7.0～8.5。

12、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(2)中fe3o4@phe溶液的濃度為1～50mg/ml。

13、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(2)中脂肪酶溶液的濃度為0.1～2mg/ml。

14、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(2)中旋轉混合的速度為50～100r/min，時間為2～60min。

15、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(3)中第三混合液中海藻酸鈉的質量百分數(shù)為1.8～2.6wt％，中空微球粉末的質量百分數(shù)為1.8～2.6wt％。

16、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(3)中加熱攪拌的速度為100～500r/min，溫度為80～100℃，時間為5～60min。

17、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(3)中生物墨水中fe3o4@phe@脂肪酶的質量百分數(shù)為0.08～0.20wt％。

18、本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟(3)中cacl2溶液的質量百分數(shù)為4～20wt％。

19、為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術方案之二為：一種fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法制得的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球。

20、為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術方案之三為：一種fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球在固定化脂肪酶中的應用。

21、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

22、1、本發(fā)明制得的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球可以使得所有脂肪酶的降解反應在油水界面進行，形成界面反應，從而提高脂肪酶的降解效率；

23、2、本發(fā)明制得的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球可以通過外部磁場完成磁分離，實現(xiàn)快速回收和重復利用，從而降低脂肪酶降解油脂的工業(yè)應用成本。

技術特征：

1.一種fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中fecl3·6h2o、fecl2·4h2o和無水乙醇的質量比為5.65:2.05:15～56.5:20.5:150，按照0.2-0.3g/ml的比例在第一混合液中加入氨水。

3.如權利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中苯丙氨酸溶液包括苯丙氨酸和氨水，苯丙氨酸溶液中苯丙氨酸濃度為0.25～1.0g/ml，苯丙氨酸為l-苯丙氨酸。

4.如權利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中加熱攪拌制得第一混合液的溫度為60～70℃，時間為5～60min，加熱攪拌制得第二混合液的溫度為70～80℃，時間為5～60min，加熱攪拌制得疏水性納米磁性顆粒fe3o4@phe溶液的溫度為80～100℃，時間為5～120min。

5.如權利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中fe3o4@phe溶液的濃度為1～50mg/ml，脂肪酶溶液的濃度為0.1～2mg/ml。

6.如權利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)和(3)中tris-hcl緩沖液的ph為7.0～8.5。

7.如權利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中旋轉混合的速度為50～100r/min，時間為2～60min，所述步驟(3)中加熱攪拌的速度為100～500r/min，溫度為80～100℃，時間為5～60min。

8.如權利要求1所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中第三混合液中海藻酸鈉的質量百分數(shù)為1.8～2.6wt％，中空微球粉末的質量百分數(shù)為1.8～2.6wt％，生物墨水中fe3o4@phe@脂肪酶的質量百分數(shù)為0.08～0.20wt％，cacl2溶液的質量百分數(shù)為4～20wt％。

9.一種如權利要求1-8任一項所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法制得的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球。

10.一種如權利要求9所述的fe3o4@phe@脂肪酶界面漂浮微球在固定化脂肪酶中的應用。

技術總結
本發(fā)明屬于酶固定化技術領域，具體公開了一種Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe@脂肪酶界面漂浮微球的制備方法及其應用，其中制備方法包括以下步驟：制備疏水性納米磁性顆粒Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe；制備生物復合物Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe@脂肪酶；3D打印Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe@脂肪酶界面漂浮微球。本發(fā)明制得的Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe@脂肪酶界面漂浮微球可以使得所有脂肪酶的降解反應在油水界面進行，加快界面反應，從而提高脂肪酶的降解效率；本發(fā)明制得的Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;@Phe@脂肪酶界面漂浮微球可以通過外部磁場完成磁分離，實現(xiàn)快速回收和重復利用，從而降低脂肪酶降解油脂的工業(yè)應用成本。

技術研發(fā)人員：池昌標,霍步青,周炫虹,陳國,黃肖慧,黃紫音,于昊洲,伯松恒
受保護的技術使用者：華僑大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/9/29