本發(fā)明涉及微生物，具體涉及一株植物乳桿菌及其在制備防治炎癥性腸病及抗氧化、抗炎和抑菌功能制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、炎癥性腸病(inflammatory?bowel?disease，ibd)是一種發(fā)生在胃腸道的慢性非特異性炎癥性疾病，分為潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative?colitis，uc)和克羅恩病(crohn'sdisease，cd)，發(fā)病率逐年增加。ibd表現(xiàn)為廣泛的病變，常擴(kuò)展到整個(gè)結(jié)腸，主要表現(xiàn)為潰瘍和結(jié)腸粘膜糜爛。ibd是一種復(fù)發(fā)性疾病，難以治愈，多發(fā)展為結(jié)直腸癌(crc)。近年來，ibd已成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題。雖然疾病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但有相當(dāng)多的證據(jù)表明該疾病是遺傳、環(huán)境和飲食因素共同作用的結(jié)果。同時(shí)，持續(xù)的腸道感染、腸道微生物失衡、腸黏膜免疫調(diào)節(jié)、腸道屏障功能異常等也與ibd的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。ibd的醫(yī)學(xué)治療側(cè)重于控制炎癥和預(yù)防疾病進(jìn)展以誘導(dǎo)緩解。傳統(tǒng)的非靶向治療，如氨基水楊酸鹽、糖皮質(zhì)激素和免疫調(diào)節(jié)劑，通常伴有強(qiáng)烈的副作用。因此，亟需研發(fā)安全有效的替代療法。

2、腸道菌群的組成和功能是影響ibd進(jìn)展的關(guān)鍵因素，腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致腸道屏障受損并引起腸道炎癥。乳酸菌可通過增加健康益生菌對(duì)腸道粘膜的粘附，抑制病原體粘附粘膜表面，競(jìng)爭(zhēng)性地消滅致病微生物，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，調(diào)節(jié)免疫功能，從而重新建立腸道共生，保護(hù)腸道黏膜。植物乳桿菌(lactiplantibacillus?plantarum，l.plantarum)屬于乳桿菌屬，是乳酸菌中最大的屬，為革蘭氏陽(yáng)性、短桿狀、微需氧、耐酸、不形成孢子、多作為發(fā)酵劑應(yīng)用于食品工業(yè)。目前，通過補(bǔ)充益生菌直接改變腸道微生物菌群的組成用于治療或緩解ibd變得很有吸引力。

3、ibd組織中ros水平顯著升高，而抗氧化物質(zhì)的水平下降。炎癥是ibd的主要表現(xiàn)，而ros在炎癥過程中起著至關(guān)重要的作用。炎癥介質(zhì)可以誘導(dǎo)ros的產(chǎn)生，過量的ros可通過nf-kb信號(hào)通路進(jìn)一步激活炎癥/免疫反應(yīng)，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌增加，加劇疾病發(fā)展。還有證據(jù)表明，cd患者腸黏膜內(nèi)炎癥細(xì)胞的ros產(chǎn)生能力明顯升高，uc患者血漿中的ros水平也明顯增加。而ros的侵襲可以損害腸道黏膜上皮屏障，引發(fā)細(xì)胞凋亡，加重腸道炎癥，并可能在腸道織織中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)和免疫炎癥反應(yīng)。同時(shí)，ibd患者常常存在抗氧化物質(zhì)的缺失。多項(xiàng)研究表明uc和cd患者血漿中多種抗氧化物質(zhì)水平顯著下降。此外，抗氧化酶活性也減弱，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一株具有良好抗氧化、抗炎、抑菌特性的植物乳桿菌及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供植物乳桿菌(lactiplantibacillus?plantarum)19-4，該菌株于2024年6月24日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，分類命名為植物乳桿菌lactiplantibacillus?plantarum，保藏編號(hào)為gdmcc?no：64788。

3、植物乳桿菌(lactiplantibacillus?plantarum)19-4分離自健康野豬糞便樣本，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，該菌株的16s?rrna的序列與植物乳桿菌一致。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株具有優(yōu)良的清除活性氧能力，以及良好的耐酸、耐膽汁酸鹽、疏水性和自聚集能力以及抑制常見病原菌等益生特性，且對(duì)常見的抗生素敏感；通過構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎模型證明該菌株對(duì)動(dòng)物無害并具有改善炎癥性腸病的功能，可減輕結(jié)腸炎小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)(disease?activityindex，dai)和結(jié)腸長(zhǎng)度的縮短，并降低結(jié)腸病理評(píng)分。同時(shí)增強(qiáng)抗氧化水平并降低炎性因子的表達(dá)從而緩解疾病損傷。本發(fā)明提供的植物乳桿菌19-4顯示出良好的益生潛力以及在預(yù)防和/或治療炎癥性腸病中的優(yōu)異應(yīng)用前景。

4、本發(fā)明提供一種菌劑，所述菌劑含有以上所述的植物乳桿菌19-4。同時(shí)包括菊粉、海藻糖、半乳甘露聚糖、纖維素粉和益生菌代謝產(chǎn)物干物質(zhì)；其中，植物乳桿菌19-4活菌數(shù)為1010～1012cfu/g。

5、本發(fā)明還提供了上述益生菌制劑的制備方法，包括以下步驟：

6、1)將上述益生菌活化：植物乳桿菌19-4接種到新鮮的液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到細(xì)菌懸液，具體流程：斜面菌種培養(yǎng)→一級(jí)液體種子培養(yǎng)→二級(jí)液體種子培養(yǎng)；

7、2)固體益生菌制劑：將上述益生菌二級(jí)種子液8000-10000rmp/min，離心10min，收集上清發(fā)酵液和沉淀。向沉淀中加入1-2倍質(zhì)量的凍干保護(hù)劑(3-7％菊粉、3-7％海藻糖)混合均勻，冷凍干燥。上清發(fā)酵液首先進(jìn)行減壓濃縮，然后進(jìn)行低溫噴霧干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為100℃，出風(fēng)溫度60℃，獲得干燥粉末。將發(fā)酵液干粉與益生菌干粉按0.5～2∶1比例混合，最后加入半乳甘露聚糖和纖維素粉，攪拌均勻；

8、3)液體復(fù)合益生菌制劑：將上述益生菌二級(jí)種子液8000-10000rmp/min，離心10min，收集沉淀和上清發(fā)酵液備用。首先對(duì)上清發(fā)酵液進(jìn)行減壓濃縮，將發(fā)酵濃縮液與益生菌沉淀按1～3：1比例混合，最后加入菊粉、海藻糖、半乳甘露聚糖和纖維素粉，攪拌均勻。

9、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的植物乳桿菌19-4具有優(yōu)良的清除活性氧能力，以及良好的耐酸、耐膽汁酸鹽、疏水性和自聚集能力以及抑制常見人體病原菌等益生特性；同時(shí)能夠改善腸道炎癥，對(duì)于炎癥性腸病具有防治功效，且具有較高的生物安全性，可作為益生菌制劑用于緩解炎癥性腸病，改善腸道粘膜損傷和結(jié)腸炎癥，為炎癥性腸病的防治提供了新的策略，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

10、經(jīng)c57bl/6小鼠結(jié)腸炎模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采用植物乳桿菌19-4菌懸液進(jìn)行21天預(yù)灌胃處理，菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無明顯毒副作用；正式干預(yù)7天后，發(fā)現(xiàn)小鼠腹瀉及血便等癥狀較模型組明顯減輕，dal顯著下降，結(jié)腸縮短癥狀以及表型明顯改善，減輕了結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸的病理?yè)p傷，降低了結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分，同時(shí)小鼠血清和肝臟的抗氧化酶活力均顯著升高，而結(jié)腸炎性因子的水平顯著降低，證明植物乳桿菌19-4可改善結(jié)腸炎小鼠的腸黏膜損傷及緩解炎癥反應(yīng)。

11、本發(fā)明中將益生菌及其代謝產(chǎn)物與多種益生元按一定比例混合，一方面多種益生元為益生菌提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)益生菌在腸道內(nèi)的增殖和定植；另一方面，上述益生菌制劑將益生菌發(fā)酵產(chǎn)物包括在內(nèi)，增加了該組合的抗菌能力，同時(shí)發(fā)酵液中含有大量的短鏈脂肪酸、吲哚衍生物等直接影響腸道脂質(zhì)代謝和屏障完整性，也避免了發(fā)酵液的廢棄。

技術(shù)特征：

1.一株植物乳桿菌(lactiplantibacillus?plantarum)，其特征在于：所述植物乳桿菌(lactiplantibacillus?plantarum)為植物乳桿菌(lactiplantibacillus?plantarum)19-4，于2024年6月24日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為gdmcc?no：64788。

2.權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌(lactiplantibacillus?plantarum)在制備防治炎癥性腸病功能制劑中的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述制劑包括所述植物乳桿菌(lactiplantibacillus?plantarum)和/或其發(fā)酵代謝產(chǎn)物。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述制劑包括菊粉、海藻糖、半乳甘露聚糖、纖維素粉中的一種或幾種。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述制劑中，植物乳桿菌(lactiplantibacillus?plantarum)活菌數(shù)為1010～1012cfu/g。

6.權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌在制備具有抗氧化功能制劑中的應(yīng)用。

7.權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌在制備具有抗炎功能制劑中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌在制備具有抑菌功能制劑中的應(yīng)用。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物乳桿菌能夠抑制大腸桿菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一株植物乳桿菌及其在制備防治炎癥性腸病及抗氧化、抗炎和抑菌功能制劑中的應(yīng)用，具有優(yōu)良的清除活性氧能力，以及良好的耐酸、耐膽汁酸鹽、疏水性和自聚集能力以及抑制常見人體病原菌等益生特性；同時(shí)能夠改善腸道炎癥，對(duì)于炎癥性腸病具有防治功效，且具有較高的生物安全性，可作為益生菌制劑用于緩解炎癥性腸病，改善腸道粘膜損傷和結(jié)腸炎癥，為炎癥性腸病的防治提供了新的策略，具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：趙海明,遲春艷,賀晚秋
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海伯納天純生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21