本發(fā)明屬于單克隆抗體，具體涉及一種抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體和檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、新型鴨呼腸孤病毒病是近年來新出現(xiàn)的水禽疫病，主要臨床特征表現(xiàn)為精神萎靡、羽毛凌亂、出雛率降低、發(fā)育遲緩、生產(chǎn)性能急劇下降，剖檢常見肝臟、脾臟不規(guī)則出血、壞死、心臟、腎臟、法氏囊出血等特征。研究發(fā)現(xiàn)，引起該病的病原為新型鴨呼腸孤病毒(novel?duckreovirus，ndrv)，該病毒屬于呼腸孤病毒科(reovirdae)、正呼腸孤病毒屬(orthoreovirus)，其基因組由10個(gè)雙鏈rna片段組成。根據(jù)呼腸孤病毒主要基因序列進(jìn)化樹分析，ndrv屬于基因2型。ndrv與位于基因1型的番鴨呼腸孤病毒(muscovyduckreovirus，mdrv)不但基因序列差異大(約60％～70％相似性)，而且侵染對(duì)象及引發(fā)的臨診癥狀及病變差異很大。mdrv只侵害7～35日齡雛番鴨，引起雛番鴨“花肝病”或“肝白點(diǎn)病”，發(fā)病率為30％～90％，病死率10％～60％。ndrv對(duì)不同水禽均可構(gòu)成威脅，其不僅可導(dǎo)致番鴨、半番鴨和鵝發(fā)生出血性壞死性肝炎，也可導(dǎo)致櫻桃谷鴨和麻鴨發(fā)生鴨脾壞死病。由于番鴨呼腸孤病毒病疫苗的免疫，由mdrv病毒引起的疫病得到了較好的控制。但目前尚無預(yù)防新型鴨呼腸孤病毒的疫苗或治療用產(chǎn)品，只能通過綜合防控措施來阻斷該病毒的流行和傳播。研制高效便捷的檢測(cè)新型鴨呼腸孤病毒的試劑來阻止病毒的流行和傳播迫在眉睫。

2、單克隆抗體因能高效、準(zhǔn)確地識(shí)別和捕捉特定抗原，被廣泛用于臨床疫病診斷、抗原和抗體驗(yàn)證以及臨床治療等方面。優(yōu)良的單克隆抗體對(duì)檢測(cè)新型鴨呼腸孤病毒方法的建立、致病機(jī)制研究和相關(guān)防控機(jī)制的形成具有重要的意義。然而目前缺乏能夠有效區(qū)分新型鴨呼腸孤病毒和鴨呼腸孤病毒以及其他類型病毒的抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體，不僅具有良好的檢測(cè)特異性，而且還具有較高的檢測(cè)靈敏度，可用于新型鴨呼腸孤病毒感染的檢測(cè)。

2、本發(fā)明提供了一種抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；

3、所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:1所示；

4、所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

5、本發(fā)明提供了一種所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體的編碼基因，包括重鏈可變區(qū)的編碼基因和輕鏈可變區(qū)的編碼基因；

6、所述重鏈可變區(qū)的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no:3所示；

7、所述輕鏈可變區(qū)的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no:4所示。

8、本發(fā)明提供了一種新型鴨呼腸孤病毒檢測(cè)試劑盒，包括所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體或具有分泌抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體的重組菌株。

9、本發(fā)明提供了一種間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)試劑盒，包括所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體、熒光標(biāo)記二抗、樣品稀釋液和洗滌液。

10、優(yōu)選的，所述的熒光標(biāo)記二抗為抗小鼠二抗。

11、優(yōu)選的，所述樣品稀釋液為濃度為0.01～0.1m、ph值為7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液。

12、優(yōu)選的，所述洗滌液為含體積百分比0.03％～0.07％吐溫20的濃度為0.01～0.1m、ph?7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液。

13、本發(fā)明提供了所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體在制備檢測(cè)新型鴨呼腸孤病毒或新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明提供了所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體在制備評(píng)估防控新型鴨呼腸孤病毒感染的疫苗的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

15、本發(fā)明提供了所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體在制備評(píng)估或監(jiān)測(cè)防控水禽病毒類活疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

16、優(yōu)選的，所述試劑或試劑盒是基于以下至少一種免疫檢測(cè)技術(shù)構(gòu)建：間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析法、免疫印跡法、免疫組化法和免疫細(xì)胞化學(xué)法。

17、本發(fā)明提供的抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:1所示；所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqid?no:2所示。本發(fā)明以重組ndrv-sigmab蛋白為免疫原免疫動(dòng)物制備脾細(xì)胞，再利用脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞融合技術(shù)篩選能穩(wěn)定分泌抗新型鴨呼腸孤病毒的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)基因測(cè)序，得到所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列，并確定抗體類型為igg1/igκ亞型。實(shí)驗(yàn)證明，所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體僅可特異性地識(shí)別新型鴨呼腸孤病毒感染，而與鴨瘟病毒、坦布蘇病毒、番鴨呼腸孤病毒和禽呼腸孤病毒等無法結(jié)合，說明本發(fā)明提供給的單克隆抗體具有良好的檢測(cè)特異性。同時(shí)靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體可以檢測(cè)到100000倍稀釋的新型鴨呼腸孤病毒，最低檢測(cè)限為100.6tcid50，同時(shí)抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體進(jìn)行1000倍稀釋后(濃度為3.8μg/ml時(shí))仍可檢測(cè)到新型鴨呼腸孤病毒，表明該單克隆抗體具有良好的靈敏度?；谒隹剐滦网喓裟c孤病毒單克隆抗體進(jìn)行病毒類活疫苗檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與血清中和試驗(yàn)結(jié)果一致?？梢姡景l(fā)明提供的抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體為新型鴨呼腸孤病毒的檢測(cè)提供了新手段。

技術(shù)特征：

1.一種抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體，其特征在于，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；

2.一種權(quán)利要求1所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體的編碼基因，其特征在于，包括重鏈可變區(qū)的編碼基因和輕鏈可變區(qū)的編碼基因；

3.一種新型鴨呼腸孤病毒檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體或具有分泌抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體的重組菌株。

4.一種間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體、熒光標(biāo)記二抗、樣品稀釋液和洗滌液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的間接免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述樣品稀釋液為濃度為0.01～0.1m、ph值為7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的間接免疫熒光試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為含體積百分比0.03％～0.07％吐溫20的濃度為0.01～0.1m、ph?7.2～7.4磷酸鹽緩沖液。

7.權(quán)利要求1所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體在制備檢測(cè)新型鴨呼腸孤病毒或新型鴨呼腸孤病毒感染的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求1所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體在制備評(píng)估防控新型鴨呼腸孤病毒感染的疫苗的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求1所述抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體在制備評(píng)估和/或監(jiān)測(cè)防控水禽病毒類活疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求7～9中任意一項(xiàng)所述應(yīng)用，其特征在于，所述試劑或試劑盒是基于以下至少一種免疫檢測(cè)技術(shù)構(gòu)建：間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法、免疫層析法、免疫印跡法、免疫組化法和免疫細(xì)胞化學(xué)法。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體、試劑或檢測(cè)試劑盒和應(yīng)用，屬于抗體技術(shù)領(lǐng)域。一種抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體，包括氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示的重鏈可變區(qū)和氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示的輕鏈可變區(qū)，屬于IgG1/Igκ亞型。本發(fā)明提供的抗新型鴨呼腸孤病毒單克隆抗體具有特異性好、敏感性強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于間接免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)檢測(cè)，也可用于水禽病毒類活疫苗中新型鴨呼腸孤病毒的外源病毒檢測(cè)以及新型鴨呼腸孤病毒的臨床監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。

技術(shù)研發(fā)人員：宋亞芬,楊承槐,張乾義,張兵,楊宵玥,張敏,閆奧陽(yáng),宮鴻軒,關(guān)飛虎,李丹
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/29