本發(fā)明屬于分子生物，具體涉及基于現(xiàn)場快速核酸擴增分析系統(tǒng)的沙門氏菌的快速檢測方法。

背景技術(shù)：

1、沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，廣泛分布于自然界，且在自然界中生存力較強，在糞便、土壤、食品、水中可生存達5個月至2年之久。它主要寄居于人和家禽、家畜的腸道中，主要污染的食品有肉、蛋、奶及其制品等。沙門氏菌的危害可分為消化系統(tǒng)癥狀、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等，會導(dǎo)致機體多發(fā)危害，嚴(yán)重者甚至?xí)＜吧踩?。?dāng)人體感染沙門氏菌時，可能誘發(fā)急性胃腸炎、傷寒或副傷寒等疾病，患者可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉、發(fā)熱、腹痛等癥狀。此外，沙門氏菌還可能危害中樞神經(jīng)，出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，包括痙攣、寒戰(zhàn)、驚厥、抽搐，甚至昏迷等。

2、目前檢測食源性沙門氏菌有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法、免疫分析方法、分子生物學(xué)方法、生物傳感器方法等。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法需要進行增菌培養(yǎng)，5-7天出結(jié)果，不能滿足快速檢測；免疫分析方法如酶聯(lián)免疫分析其靈敏度還有待提高，免疫層析試紙條對抗體特特異性要求高易出現(xiàn)假陽性；而生物傳感器檢測方法對實驗人員的操作和實驗環(huán)境要求較高，不適合在基層推廣；分子生物學(xué)技術(shù)具有高特異性、高靈敏度、快速簡便的特點，最關(guān)鍵的是可以對混合樣本進行檢測，不需要進行沙門氏菌分離，然而在實際操作過程中需要專業(yè)人員進行核酸提取、擴增，涉及到轉(zhuǎn)管，可能產(chǎn)生污染，也需要一定的實驗環(huán)境，大大地限制了在無專業(yè)實驗室環(huán)境和操作人員的基層機構(gòu)快速檢測和篩查沙門氏菌的應(yīng)用。因此需要一種操作簡便、無需專業(yè)操作人員分析的快速現(xiàn)場檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種沙門氏菌的核酸擴增分析系統(tǒng)實現(xiàn)了沙門氏菌快速現(xiàn)場檢測。

2、一方面，本發(fā)明提供了一種沙門氏菌的核酸擴增分析系統(tǒng)，所述的核酸擴增分析系統(tǒng)包括核酸提取純化體系和實時熒光定量pcr；

3、73?所述的核酸提取純化體系包括核酸結(jié)合液；

4、74?所述的核酸結(jié)合液是由以下成分組成：3-5m鹽酸胍、0.2-0.3m月桂酰基谷75氨酸鈉、0.2-0.3m月桂酰甘氨酸鈉、0.3-0.5m檸檬酸鈉和1％-2％v/v?tween20，76?15mmedta。

5、77具體地，一些實施例中所述的核酸結(jié)合液是由以下成分組成：3m鹽酸胍、780.2m月桂?；劝彼徕c、0.3m月桂酰甘氨酸鈉、0.5m檸檬酸鈉、2％v/v79tween20，8mmedta。

6、80具體地，一些實施例中所述的核酸結(jié)合液是由以下成分組成：5m鹽酸胍、810.3m月桂?；劝彼徕c、0.2m月桂酰甘氨酸鈉、0.3m檸檬酸鈉、1％v/v82tween20，15mmedta。

7、83具體地，所述的核酸提取純化體系還包括裂解液、結(jié)合緩沖液、磁珠、洗滌84液和洗脫液。

8、85?進一步具體地，所述裂解液的成分包括tris-hcl和edta；

9、86?所述結(jié)合緩沖液的成分包括tris-hcl、edta和nacl，ph?7.5；

10、87?所述洗滌液的成分包括鹽酸胍、tween20和edta。

11、88?所述洗脫液的成分包括tris-hcl，ph8.5。

12、89?具體地，所述的實時熒光定量pcr體系包括引物和探針；所述的引物序列90為seq?id?no.1-seq?id?no.2，探針序列為seq?id?no.3。

13、91進一步具體地，所述的實時熒光定量pcr體系還包括陽性對照和陰性對照92中的一種或多種。

14、93又一方面，本發(fā)明提供了一種檢測沙門氏菌的試劑盒，所述的試劑盒包括前94述的核酸擴增分析系統(tǒng)。

15、95又一方面，本發(fā)明提供了前述的核酸擴增分析系統(tǒng)或試劑盒在現(xiàn)場快速檢測96沙門氏菌中的應(yīng)用。

16、97又一方面，本發(fā)明提供了一種現(xiàn)場快速檢測沙門氏菌的方法，所述的方法包98括以下步驟：

17、99?s1、裂解樣品釋放核酸；

18、100?s2、所述的純化步驟s1中的核酸；

19、101?s3、對步驟s2純化后的核酸進行實時熒光定量pcr；

20、s4、結(jié)果判定；

21、步驟s2所述的純化包括使用權(quán)利要求1中所述的核酸結(jié)合液。

22、具體地，步驟s3所述實時熒光定量pcr的引物和探針分別為seq?id?no.1-seq?idno.2和seq?id?no.3。

23、具體地，步驟s3所述實時熒光定量pcr所使用的儀器為實時熒光定量pcr儀或手持熒光實時定量pcr一體機。

24、優(yōu)選地，步驟s3所述實時熒光定量pcr所使用的儀器為手持熒光實時定量pcr一體機。

25、具體地，步驟s3所述實時熒光定量pcr的程序為：

26、

27、優(yōu)選地，步驟s3所述實時熒光定量pcr的程序為：

28、

29、本發(fā)明所取得的技術(shù)效果：

30、(1)本發(fā)明的檢測方法不需要增殖培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)和生化鑒定，大大縮短了檢測時間。

31、(2)不需要均質(zhì)器、培養(yǎng)箱、真空泵等設(shè)備，減少現(xiàn)場檢測所帶實驗器材，有利于沙門氏菌的現(xiàn)場快速檢測。

32、(3)本發(fā)明提供的磁珠法核酸試劑盒進行核酸提取，所得核酸的質(zhì)量可滿足后續(xù)的實時熒光pcr反應(yīng)。

33、(4)本發(fā)明提供的引物和探針在7500熒光實時pcr儀和現(xiàn)場快速核酸擴增分析系統(tǒng)均具有特異性，靈敏度。

技術(shù)特征：

1.一種沙門氏菌的核酸擴增分析系統(tǒng)，其特征在于，所述的核酸擴增分析系統(tǒng)包括核酸提取純化體系和實時熒光定量pcr體系；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸擴增分析系統(tǒng)，其特征在于，所述的核酸提取純化體系還包括裂解液、結(jié)合緩沖液、磁珠、洗滌液和洗脫液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸擴增分析系統(tǒng)，其特征在于，所述的實時熒光定量pcr體系包括序列如seq?id?no.1-seq?id?no.2所示的引物和序列如seq?id?no.3所示的探針。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸擴增分析系統(tǒng)，其特征在于，所述的實時熒光定量pcr體系還包括陽性對照和陰性對照中的一種或多種。

5.一種檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括權(quán)利要求1-4任一項所述的核酸擴增分析系統(tǒng)。

6.權(quán)利1-4任一項所述的核酸擴增分析系統(tǒng)或權(quán)利要求5所述的試劑盒在現(xiàn)場快速檢測沙門氏菌中的應(yīng)用。

7.一種現(xiàn)場快速檢測沙門氏菌的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟s3所述實時熒光定量pcr的引物和探針分別為seq?id?no.1-seq?id?no.2和seq?id?no.3。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟s3所述實時熒光定量pcr所使用的儀器為實時熒光定量pcr儀或手持熒光實時定量pcr一體機。

10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，步驟s3所述實時熒光定量pcr的反應(yīng)程序為：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于現(xiàn)場快速核酸擴增分析系統(tǒng)的沙門氏菌的快速檢測方法。所述的核酸擴增分析系統(tǒng)包括核酸提取純化體系和實時熒光定量PCR體系；所述的核酸提取純化體系包括核酸結(jié)合液，其成分包括：3?5M鹽酸胍、0.2?0.3M月桂?；劝彼徕c、0.2?0.3M月桂酰甘氨酸鈉、0.3?0.5M檸檬酸鈉、1％?2％v/v?Tween20，15mM?EDTA；所述的實時熒光定量PCR系包括序列如SEQ?ID?NO.1?SEQ?ID?NO.2所示的引物和序列如SEQ?ID?NO.3所示的探針。本發(fā)明提供的核酸擴增分析系統(tǒng)能實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測沙門氏菌，具有時間短、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點。

技術(shù)研發(fā)人員：嚴(yán)江偉,霍雨美,郭相杰,劉晉玎,高妞,張曉萌,王甜
受保護的技術(shù)使用者：山西醫(yī)科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/29