本發(fā)明屬于細(xì)胞核提取，具體涉及一種細(xì)胞核提取試劑盒在植物組織細(xì)胞核的提取和純化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)得到了蓬勃的發(fā)展，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類物種（特別是人、小鼠等）的不同類型組織和細(xì)胞系，包括對正常和病變細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。但對于植物組織和植物細(xì)胞開展單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序還面臨著不小的挑戰(zhàn)：植物細(xì)胞被固定在剛性細(xì)胞壁基質(zhì)中，分離單細(xì)胞時需要將其移除；植物細(xì)胞壁的酶消化是一種重要的脅迫源，容易刺激植物細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)壓力應(yīng)答基因的表達(dá)，人為引入轉(zhuǎn)錄偏差；植物原生質(zhì)體大小存在可變性（滲透壓導(dǎo)致的原生質(zhì)體脹大）；質(zhì)體細(xì)胞器、和液泡中存在可與rna相互作用的次級代謝物；不同組織類型間適用的酶組合不同，需要優(yōu)化消化細(xì)胞壁所需的酶；制備的原生質(zhì)體很脆弱，活性波動大。而植物單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序，可以較好地克服上述困難。但目前還缺少通用的植物細(xì)胞核提取試劑和方法，尤其是凍存植物細(xì)胞核提取試劑和方法。鑒于此，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種適用于冷凍植物或新鮮植物的單細(xì)胞核提取純化方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決新鮮植物樣本采集后不能立即進(jìn)行細(xì)胞核提取、凍存的回顧性樣本細(xì)胞核提取后資源利用以及剩余樣本凍存后的再檢測的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種植物細(xì)胞核提取的試劑盒及其應(yīng)用。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)手段：

3、本發(fā)明的第一方面在于提供一種植物細(xì)胞核提取的試劑盒，用于提取凍存或新鮮植物組織的細(xì)胞核，包括提取試劑和純化試劑；

4、所述提取試劑包括離子緩沖液、金屬陽離子、酸根陰離子、edta、亞精胺（spermidine）、精胺（spermine）和dtt；

5、所述純化試劑包括tris-hcl、蔗糖、氯離子、鉀離子、鎂離子、鈉離子和bsa；

6、優(yōu)選地，所述提取試劑中的離子緩沖液為mes，濃度為20-30mm；mes為兩性離子緩沖液，其pka值接近生理ph值，水溶性好，且不易溶于其他溶劑，不易螯合鹽離子；

7、優(yōu)選地，所述提取試劑中的金屬陽離子包括鈉離子、鎂離子和鉀離子；所述酸根陰離子選自氯離子、硝酸根離子和硫酸根離子中的至少一種；所述鈉離子的濃度為45-55mm；所述酸根陰離子為氯離子，氯離子的濃度為150-190mm；所述鉀離子的濃度為95-105mm、所述鎂離子的濃度為5-15mm；

8、優(yōu)選地，所述提取試劑中的edta的濃度為2-6mm；edta可以防止金屬離子激活蛋白酶，從而減少金屬離子對核酸質(zhì)量的影響；

9、優(yōu)選地，所述提取試劑中的spermidine的濃度為0.2-0.6mm；所述提取試劑中的spermine的濃度為0.20-0.30mm；所述提取試劑中的dtt的濃度為0.3-0.7mm；

10、優(yōu)選地，所述純化試劑中蔗糖的濃度為0.2-0.6mm；所述純化試劑中的tris-hcl的ph為7.4，其濃度為5-15mm；所述純化試劑中的鉀離子的濃度為15-25mm；所述純化試劑中的鎂離子的濃度為5-15mm；所述純化試劑中的鈉離子的濃度為5-15mm；所述純化試劑中的氯離子來自氯化鈉、氯化鎂和氯化鉀；

11、優(yōu)選地，所述純化試劑中的bsa的濃度為0.1wt%；

12、本發(fā)明的第二方面在于分別提供一種植物細(xì)胞核提取的提取試劑和純化試劑的配制方法：

13、提取試劑按照下表所示進(jìn)行組分添加配制：

14、

15、按上表所示1-8的序號配制溶液，并混勻后在2-8℃下保存，并且在使用前加入dtt；

16、純化試劑按照下表所示進(jìn)行組分添加配制：

17、

18、根據(jù)上表將溶液混勻后于2-8℃下保存。

19、本發(fā)明的第三方面在于提供本發(fā)明第一方面所述的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

20、s1，取植物組織于干冰預(yù)冷的研缽中，置于干冰上進(jìn)行研磨至粉末狀；

21、s2，將研磨后的植物組織轉(zhuǎn)至2-8℃預(yù)冷的提取試劑中，用70μm細(xì)胞過濾篩過濾，收集濾液；

22、s3，在4℃下，將s2所得的濾液進(jìn)行離心，離心結(jié)束后棄上清液，得到第一沉淀；

23、s4，用純化試劑對s3所得到的第一沉淀進(jìn)行重懸，并用20μm細(xì)胞過濾篩過濾，收集濾液；

24、s5，在4℃下，將s4所得的濾液進(jìn)行離心，離心結(jié)束后棄上清液，得到第二沉淀；

25、s6，將s5所得的第二沉淀進(jìn)一步用純化試劑進(jìn)行重懸，得到混合物；

26、s7，將s6所得的混合物用流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞核，收集分選后的細(xì)胞核，用臺盼藍(lán)染色在顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)，并進(jìn)行熒光染色計數(shù)。

27、優(yōu)選地，步驟s1中，所述植物組織可以為新鮮采集的植物組織或者凍存的植物組織；

28、優(yōu)選地，步驟s2中，植物組織與提取試劑的質(zhì)量體積比為1:20（g/ml）；

29、優(yōu)選地，步驟s4中，第一沉淀與純化試劑的質(zhì)量體積比為1:10（g/ml）

30、優(yōu)選地，步驟s6中，第二沉淀與純化試劑的質(zhì)量體積比為1:10（g/ml）；

31、本發(fā)明的第四方面在于提供本發(fā)明第一方面所述的試劑盒在凍存或新鮮植物組織中的細(xì)胞核提取、純化中的應(yīng)用。

32、本發(fā)明的有益效果

33、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

34、（1）本發(fā)明提供的一種植物細(xì)胞核提取的試劑盒，用于植物細(xì)胞核的提取純化，得到的細(xì)胞核核膜完整、基因表達(dá)穩(wěn)定，可用于基因檢測和研究。

35、（2）本發(fā)明提供的試劑盒的使用方法，簡單易操作，原材料易獲得，價格低廉，試劑組分具有良好生物相容性，無有害成分，安全環(huán)保。

36、（3）本發(fā)明所提供的試劑盒的使用方法，區(qū)別于常規(guī)的新鮮植物細(xì)胞核提取純化方法，本方法不僅能提取新鮮植物細(xì)胞核提取純化，且能有效提取液氮凍存的植物細(xì)胞核，使很多不易獲得、不能立即進(jìn)行實驗處理、回顧性、動態(tài)監(jiān)測、溯源性檢測等樣本進(jìn)行有效利用。

技術(shù)特征：

1.一種細(xì)胞核提取試劑盒在植物組織細(xì)胞核的提取和純化中的應(yīng)用，其特征在于，所述植物組織包括新鮮植物樣本和凍存植物樣本；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種植物細(xì)胞核提取的試劑盒，用于提取凍存或新鮮植物組織的細(xì)胞核，包括提取試劑和純化試劑；所述提取試劑包括離子緩沖液、金屬陽離子、酸根陰離子、EDTA、亞精胺、精胺和DTT；所述純化試劑包括Tris?HCl、蔗糖、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈉和BSA。本發(fā)明所提供的試劑盒用于植物細(xì)胞核的提取純化，得到的細(xì)胞核核膜完整、基因表達(dá)穩(wěn)定，可用于基因檢測和研究。本發(fā)明提供的試劑盒的使用方法，簡單易操作，原材料易獲得，價格低廉，試劑組分具有良好生物相容性，無有害成分，安全環(huán)保。

技術(shù)研發(fā)人員：楊歡歡,張漢虞,潘煜,陳天翔,林建雄
受保護(hù)的技術(shù)使用者：杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/29