本發(fā)明屬于動(dòng)物細(xì)胞生物學(xué)，尤其涉及一種葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型及其建立方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近十年來(lái)，類器官技術(shù)作為一個(gè)整體技術(shù)領(lǐng)域系統(tǒng)地在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)研究學(xué)科得以應(yīng)用，基于其自組織能力，收獲具有誘導(dǎo)形成多功能器官能力的干細(xì)胞，可以體外形成結(jié)構(gòu)和功能與體內(nèi)對(duì)應(yīng)物相似的3d結(jié)構(gòu)。在營(yíng)養(yǎng)對(duì)腸道健康影響領(lǐng)域相關(guān)研究中，類器官模型與多個(gè)學(xué)科交叉應(yīng)用發(fā)揮作用。類器官最顯著的特點(diǎn)是具有強(qiáng)大的自我更新能力，不僅在細(xì)胞譜系組成上與腸上皮組織高度相似，其功能特性也與來(lái)源組織保持高度一致。

2、目前基于嚙齒類動(dòng)物、犬等動(dòng)物模型開(kāi)展腸道營(yíng)養(yǎng)生物學(xué)的研究已取得重大進(jìn)展，但依然存在一些技術(shù)上的局限性。由于上述動(dòng)物與人類之間，在解剖結(jié)構(gòu)和生理特性方面存在明確差異而限制了這些模型的應(yīng)用。例如小鼠模型缺乏代表人類胃腸道疾病的關(guān)鍵臨床癥狀和病理變化，從而限制了用小鼠為模型開(kāi)展臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究；犬類由于社會(huì)倫理問(wèn)題，在相關(guān)研究中的使用也被廣泛限制。相比較而言，豬與人類有多個(gè)共同的特征，例如相似的營(yíng)養(yǎng)需求、相近的代謝過(guò)程、相應(yīng)的免疫功能，并且豬在胃腸道解剖和生理上表現(xiàn)出與人類相似的結(jié)構(gòu)。因此，豬小腸類器官具有上述體內(nèi)外研究模型的優(yōu)勢(shì)。

3、雖然，腸道類器官3d培養(yǎng)模型是研究組織成體干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及器官形成的新興體外研究系統(tǒng)，是腸道生物學(xué)研究領(lǐng)域里程碑式的研究成果，但是該培養(yǎng)方法形成的類器官在一些模擬真實(shí)腸道環(huán)境的應(yīng)用中仍然存在一定的不足。這是因?yàn)槟c道類器官3d培養(yǎng)物由于其腸腔面被包裹在球形結(jié)構(gòu)的腔體內(nèi)側(cè)，阻礙了其與外界環(huán)境的接觸，導(dǎo)致對(duì)腸道營(yíng)養(yǎng)健康的研究受阻。此外，3d培養(yǎng)類器官的內(nèi)腔會(huì)積聚來(lái)自細(xì)胞更新的碎片，其可阻礙注射物質(zhì)與頂膜的相互作用，從而對(duì)整個(gè)類器官的培養(yǎng)造成影響。因此，優(yōu)化培養(yǎng)程序并形成更方便操作的體外類器官應(yīng)用模型具有一定現(xiàn)實(shí)意義，也正是本文所解決的技術(shù)問(wèn)題之一。

4、有研究表明葡聚糖硫酸鈉(dss)在典型的仔豬中持續(xù)應(yīng)用3-15天可誘發(fā)結(jié)腸炎，dss也可用于豬小腸類器官損傷模型的建立。dss是由蔗糖合成的肝素樣硫酸多糖體，在誘導(dǎo)腸道炎癥中具有重要的作用?；瘜W(xué)誘導(dǎo)的腸道炎癥模型是最常用的炎性損傷模型，且dss對(duì)腸道屏障的破壞作用已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，但利用dss誘導(dǎo)建立豬小腸類器官的損傷模型方法目前沒(méi)有形成完整體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型及其建立方法和應(yīng)用，本發(fā)明提出的小腸類器官2d模型使生物活性物質(zhì)的功能性研究更加符合真實(shí)生理情況，能為高通量的營(yíng)養(yǎng)素篩選和生物活性物質(zhì)功能鑒定提供更為簡(jiǎn)易、方便的操作，彌補(bǔ)了3d腸道類器官腸腔面無(wú)法與培養(yǎng)環(huán)境直接接觸，導(dǎo)致對(duì)腸道營(yíng)養(yǎng)與健康相關(guān)研究可行性差的問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型的建立方法，包括以下步驟：

3、(1)基質(zhì)膠(matrigel)與預(yù)冷處理后的pbs以體積比1:20混合，得基質(zhì)膠溶液；

4、(2)于細(xì)胞培養(yǎng)板中依次加入步驟(1)所得基質(zhì)膠溶液和pbs，第一靜置培養(yǎng)，吸出pbs，得預(yù)處理細(xì)胞培養(yǎng)板；

5、(3)向步驟(2)所得預(yù)處理細(xì)胞培養(yǎng)板中再次加入pbs，第二靜置培養(yǎng)，再次吸出pbs，重復(fù)3次，得基質(zhì)膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)板；

6、(4)豬小腸類器官單細(xì)胞懸液加入步驟(3)所得基質(zhì)膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)，得豬小腸類器官2d培養(yǎng)物；

7、(5)取步驟(4)所得豬小腸類器官2d培養(yǎng)物置于添加葡聚糖硫酸鈉(dss)的培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)培養(yǎng)12h，得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型。

8、優(yōu)選的，步驟(1)中所述預(yù)冷處理為在4℃靜置處理12～24h。

9、優(yōu)選的，步驟(2)中所述細(xì)胞培養(yǎng)板為48孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

10、優(yōu)選的，步驟(2)中所述基質(zhì)膠溶液與pbs等體積加入。

11、優(yōu)選的，步驟(2)中所述第一靜置培養(yǎng)的溫度為37℃，所述第一靜置培養(yǎng)的環(huán)境中co2的體積分?jǐn)?shù)為5％，所述第一靜置培養(yǎng)的時(shí)間為2h。

12、優(yōu)選的，步驟(3)中所述再次加入pbs的用量與步驟(2)中pbs的用量相同，步驟(3)中所述第二靜置培養(yǎng)的溫度為37℃，所述第二靜置培養(yǎng)的環(huán)境中co2的體積分?jǐn)?shù)為5％，所述第二靜置培養(yǎng)的時(shí)間為5min。

13、優(yōu)選的，步驟(4)中所述豬小腸類器官單細(xì)胞懸液的濃度為104/ml，所述豬小腸類器官單細(xì)胞懸液的用量與步驟(2)中基質(zhì)膠溶液的用量相同；步驟(4)中所述細(xì)胞培養(yǎng)的溫度為37℃，所述細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境中co2的體積分?jǐn)?shù)為5％，所述細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間為2～4d。

14、優(yōu)選的，步驟(5)中所述添加葡聚糖硫酸鈉的培養(yǎng)液中葡聚糖硫酸鈉的濃度為100～400μmol/l；步驟(5)中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為37℃，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的環(huán)境中co2的體積分?jǐn)?shù)為5％。

15、優(yōu)選的，步驟(5)中所述培養(yǎng)液以dmem/f12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，添加fbs和anti-anti。

16、本發(fā)明還提供了所述建立方法建立所得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型。

17、本發(fā)明還提供了所述建立方法建立所得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型或所述葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型在制備治療、檢測(cè)或預(yù)測(cè)豬小腸炎癥疾病產(chǎn)品中的應(yīng)用。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：

19、本發(fā)明利用細(xì)胞2d培養(yǎng)有效減小3d培養(yǎng)過(guò)程中由于內(nèi)腔積聚的碎片阻礙注射物質(zhì)與頂膜相互作用的影響，提供的小腸類器官2d模型使生物活性物質(zhì)的功能性研究更加符合真實(shí)生理情況，能為高通量的營(yíng)養(yǎng)素篩選和生物活性物質(zhì)功能鑒定提供更為簡(jiǎn)易、方便的操作，彌補(bǔ)了3d腸道類器官腸腔面無(wú)法與培養(yǎng)環(huán)境直接接觸，導(dǎo)致對(duì)腸道營(yíng)養(yǎng)與健康相關(guān)研究可行性差的問(wèn)題。提供一種豬小腸類器官2d損傷模型的建立方法，采用matrigel鋪膠法建立豬小腸類器官2d模型，利用葡聚糖硫酸鈉刺激形成豬小腸類器官2d損傷模型。

技術(shù)特征：

1.一種葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立方法，其特征在于，步驟(1)中所述預(yù)冷處理為在4℃靜置處理12～24h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立方法，其特征在于，步驟(2)中所述細(xì)胞培養(yǎng)板為48孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立方法，其特征在于，步驟(2)中所述基質(zhì)膠溶液與pbs等體積加入。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立方法，其特征在于，步驟(2)中所述第一靜置培養(yǎng)的溫度為37℃，所述第一靜置培養(yǎng)的環(huán)境中co2的體積分?jǐn)?shù)為5％，所述第一靜置培養(yǎng)的時(shí)間為2h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立方法，其特征在于，步驟(3)中所述再次加入pbs的用量與步驟(2)中pbs的用量相同，步驟(3)中所述第二靜置培養(yǎng)的溫度為37℃，所述第二靜置培養(yǎng)的環(huán)境中co2的體積分?jǐn)?shù)為5％，所述第二靜置培養(yǎng)的時(shí)間為5min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立方法，其特征在于，步驟(4)中所述豬小腸類器官單細(xì)胞懸液的濃度為104/ml，所述豬小腸類器官單細(xì)胞懸液的用量與步驟(2)中基質(zhì)膠溶液的用量相同；步驟(4)中所述細(xì)胞培養(yǎng)的溫度為37℃，所述細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境中co2的體積分?jǐn)?shù)為5％，所述細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間為2～4d。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立方法，其特征在于，步驟(5)中所述添加葡聚糖硫酸鈉的培養(yǎng)液中葡聚糖硫酸鈉的濃度為100～400μmol/l，步驟(5)中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為37℃，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的環(huán)境中co2的體積分?jǐn)?shù)為5％。

9.如權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述建立方法建立所得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型。

10.如權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述建立方法建立所得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型或權(quán)利要求9所述葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2d損傷模型在制備治療、檢測(cè)或預(yù)測(cè)豬小腸炎癥疾病產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2D損傷模型及其建立方法和應(yīng)用，屬于動(dòng)物細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，提供的一種葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2D損傷模型的建立方法，包括以下步驟：基質(zhì)膠與PBS混合得基質(zhì)膠溶液；細(xì)胞培養(yǎng)板中加入基質(zhì)膠溶液和PBS培養(yǎng)，吸出PBS，再次加入PBS，培養(yǎng)，吸出PBS，重復(fù)3次，得基質(zhì)膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)板；豬小腸類器官單細(xì)胞懸液加入基質(zhì)膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)，得豬小腸類器官2D培養(yǎng)物；置于添加葡聚糖硫酸鈉的培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)，得葡聚糖硫酸鈉致豬小腸類器官2D損傷模型。本發(fā)明為高通量的營(yíng)養(yǎng)素篩選和生物活性物質(zhì)功能鑒定提供更為簡(jiǎn)易、方便的操作。

技術(shù)研發(fā)人員：韓菲菲,劉琪,趙霞,金雨齊,劉瑋琳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江工商大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21