本發(fā)明涉及分子生物學，尤其涉及啟動子及其在構(gòu)建產(chǎn)麥角甾醇的酵母菌株中的應用。

背景技術(shù)：

1、啟動子（promoters）是dna分子上一段特定的核苷酸序列，它位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游的dna序列，能活化rna聚合酶，使之與模板dna準確的結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。啟動子通過與特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄復合物，進而啟動rna聚合酶在dna模板上的移動，從而開始轉(zhuǎn)錄過程。在基因表達過程中，啟動子起著至關(guān)重要的作用，它決定了基因轉(zhuǎn)錄的起始點，并影響著轉(zhuǎn)錄的效率。不同的基因可能具有不同的啟動子序列，不同物種的同工酶的啟動子序列也存在差異，這些序列的差異會導致基因表達的特異性和調(diào)控的復雜性。

2、酵母作為一種廣泛使用的模式生物，在基因表達與產(chǎn)物收獲方面展現(xiàn)了巨大的潛力。其優(yōu)點在于生長迅速、易于培養(yǎng)，并且具有相對簡單的基因組結(jié)構(gòu)，這使得酵母成為基因工程的理想宿主。通過基因工程技術(shù)，科學家可以將目的基因插入酵母的基因組中，實現(xiàn)外源基因的高效表達。同時，酵母細胞內(nèi)的代謝途徑清晰，可以通過代謝工程進一步優(yōu)化基因表達過程，提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度。此外，酵母細胞還能對特定的環(huán)境條件作出響應，如通過調(diào)整溫度、ph值或添加誘導劑等方式，觸發(fā)特定基因的表達，從而實現(xiàn)對產(chǎn)物表達的精確控制。

3、目前，酵母作為一種模式生物，在基因表達與產(chǎn)物收獲領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。然而，傳統(tǒng)的酵母啟動子在實際應用中往往會遇到表達效率不足或產(chǎn)物產(chǎn)量較低的問題。為了解決這一難題，研究者們開始對酵母啟動子進行優(yōu)化。啟動子優(yōu)化的方法包括改變啟動子序列的堿基組成、增加或刪除特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、調(diào)整啟動子與基因之間的距離等。通過這些策略，研究者們可以有效地提高啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，從而增加目的基因的表達效率，進一步提升產(chǎn)物的產(chǎn)量。當前，針對釀酒酵母的啟動子尚有較大的優(yōu)化空間。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供啟動子及其在構(gòu)建產(chǎn)麥角甾醇的酵母菌株中的應用，以期提高釀酒酵母工程菌株的次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，特別是麥角甾醇的產(chǎn)量。

2、本發(fā)明提供的啟動子包括片段a和片段b；

3、所述片段a具有如seq?id?no:1所示的核酸序列；

4、所述片段b具有如seq?id?no:2~9至少一項所示的核酸序列。

5、本發(fā)明對酵母菌，特別是釀酒酵母的啟動子進行改造，在野生型啟動子（seq?idno:1所示）的基礎(chǔ)上添加另一啟動子形成啟動子。本發(fā)明對片段a和片段b的連接關(guān)系不做限定，例如，片段a可在n端也可以在n端。

6、一些實施例中，片段a位于啟動子的n端。

7、一些實施例中，片段b為來源不同的啟動子，與片段a連接形成的新的啟動子的核酸序列如seq?id?no:10~17中任一項所示?；蛘呔唧w在如前所述的片段中取代、缺失或添加一個或多個核苷酸的核酸；或者與如前所述的核酸序列具有至少90%同一性。

8、實驗表明，相對于野生型啟動子而言，seq?id?no:10~17中任一項所示的啟動子都能夠提高麥角甾醇的產(chǎn)量，其中，seq?id?no:10、seq?id?no:11、seq?id?no:13或seq?idno:14所示的啟動子促進麥角甾醇產(chǎn)量的效果與野生型相比存在顯著性差異（p<0.05）。其中，seq?id?no:11所示的啟動子在提高麥角甾醇產(chǎn)量方面存在更顯著的效果（p<0.01）。此外，相對于野生型啟動子而言，本發(fā)明提供的啟動子還能夠降低雜質(zhì)的占比，特別是seq?idno:11所示的啟動子，相對于野生型啟動子能夠極顯著降低雜質(zhì)的含量（p<0.001）。

9、本發(fā)明還提供了如前所述啟動子在提高酵母基因表達水平中的應用。

10、本發(fā)明中，所述酵母為釀酒酵母、假絲酵母、球擬酵母、紅酵母、耶氏酵母、漢遜酵母、畢赤酵母或克魯維酵母。

11、進一步的，本發(fā)明還提供了表達單元，其包括如前所述的啟動子和目的基因。

12、本發(fā)明中，所述目的基因為erg4基因、erg2基因或erg3基因。

13、作為可行性案例，所述表達單元中還包括終止子，所述終止子為終止子tadh1、終止子tpdc1或具有seq?id?no:18?所示核酸序列的終止子。

14、另一些可行案例中，所述表達單元中，還包括增強子、轉(zhuǎn)座子或側(cè)翼序列中的至少一種。

15、更進一步的，本發(fā)明還提供了一種質(zhì)粒載體，其包括如前所述的啟動子或包括如前所述的表達單元。

16、本發(fā)明中，所述質(zhì)粒載體為穿梭載體，或酵母表達載體。本發(fā)明對此不做限定。作為舉例，所述質(zhì)粒載體的骨架為pscm-n20質(zhì)粒和/或phcas9質(zhì)粒。

17、更進一步的，本發(fā)明還提供了一種酵母工程菌，其包括如前所述的質(zhì)粒載體，或基因組中整合有如前所述的啟動子或包括如前所述的表達單元。

18、一些實施例中，本發(fā)明所述的酵母工程菌的底盤菌為cctcc?no:?m2016418，其erg4基因的啟動子為如前所述的啟動子。

19、更進一步的，本發(fā)明還提供了一種麥角甾醇的制備方法，其包括，培養(yǎng)如前所述的酵母工程菌，獲得含有麥角甾醇的發(fā)酵產(chǎn)物。

20、本發(fā)明中，所述含有麥角甾醇的發(fā)酵產(chǎn)物是發(fā)酵后的菌液、經(jīng)分離的上清液或濕酵母。本發(fā)明中，所述麥角甾醇的制備還包括將濕酵母與片堿、氯化鈉和無水乙醇混合，經(jīng)90℃處理8h后，用正已烷進行萃取，經(jīng)洗滌、濃縮后結(jié)晶獲得麥角甾醇。

21、本發(fā)明對酵母菌，特別是釀酒酵母的啟動子進行改造，在野生型啟動子（seq?idno:1所示）的基礎(chǔ)上添加另一啟動子形成新的啟動子。含有該啟動子添加在erg4基因的起始位置上，構(gòu)建獲得的產(chǎn)麥角甾醇的釀酒酵母菌株，麥角甾醇含量可達3.0~3.3?mg/g?dcw，產(chǎn)量提升150%左右；甾醇類雜質(zhì)占比為6.675%，比野生型菌株雜質(zhì)占比下降50%左右。

技術(shù)特征：

1.啟動子，其核酸序列如seq?id?no:11所示。

2.權(quán)利要求1所述的啟動子在提高酵母基因表達水平中的應用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述基因為erg4基因，所述酵母為釀酒酵母。

4.表達單元，其包括權(quán)利要求1所述的啟動子和目的基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達單元，其特征在于，所述目的基因為erg4基因。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的表達單元，其特征在于，所述表達單元中還包括終止子，所述終止子的核酸序列如seq?id?no:18所示。

7.質(zhì)粒載體，其包括權(quán)利要求1所述的啟動子或包括權(quán)利要求4~6任一項所述的表達單元。

8.酵母工程菌，其包括權(quán)利要求7所述的質(zhì)粒載體，或基因組中整合有權(quán)利要求1所述的啟動子或包括權(quán)利要求4~6任一項所述的表達單元。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的酵母工程菌，其特征在于，其底盤菌為cctcc?no:?m2016418，其erg4基因的啟動子為權(quán)利要求1所述的啟動子。

10.麥角甾醇的制備方法，其包括，培養(yǎng)權(quán)利要求8或9所述的酵母工程菌，獲得含有麥角甾醇的發(fā)酵產(chǎn)物。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及啟動子及其在構(gòu)建產(chǎn)麥角甾醇的酵母菌株中的應用。本發(fā)明對酵母菌，特別是釀酒酵母的啟動子進行改造。含有該啟動子添加在ERG4基因的起始位置上，構(gòu)建獲得的產(chǎn)麥角甾醇的釀酒酵母菌株，麥角甾醇含量可達3.0~3.3?mg/g?DCW，產(chǎn)量提升150%左右；甾醇類雜質(zhì)占比為6.675%，比野生型菌株雜質(zhì)占比下降50%左右。

技術(shù)研發(fā)人員：王雅嗣,覃先武,陳暉,張彥,顧小松,劉秀繼,楊玉賢
受保護的技術(shù)使用者：安琪酵母（濱州）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/29