一種利用irap分子標記對馬尾松種質鑒定的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及基于馬尾松基因組開發(fā)的IRAP標記及其應用。 基于馬尾松LTR反轉錄轉座子序列，開發(fā)的8條IRAP標記引物，能從DNA水平對馬尾松進 行種質鑒定及親緣關系分析。
【背景技術】
[0002] 馬尾松（Pinus massoniana)以速生、豐產(chǎn)、適應能力強、分布廣、全樹綜合利用率 高、用途廣泛等優(yōu)良特性，而成為我國南方最主要優(yōu)質針葉用材樹種之一，在我國森林資源 發(fā)展、林紙一體化、松香林產(chǎn)化工業(yè)及森林生態(tài)服務功能中具有重要地位，其中，馬尾松優(yōu) 良種質的發(fā)掘和保護對產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展至關重要。因此，馬尾松種質的準確、高效鑒定和親 緣關系分析，對種質的知識產(chǎn)權保護、開發(fā)和利用具有重要現(xiàn)實意義。
[0003] 隨著分子生物學的發(fā)展，DNA分子標記技術被廣泛用于馬尾松種質鑒定和親緣關 系分析。與其它遺傳標記(形態(tài)學標記、生物化學標記、細胞學標記）相比，分子標記的優(yōu) 越性有：大多數(shù)為共顯性，對隱性性狀的選擇十分便利；基因組變異豐富，分子標記數(shù)量極 多；不同發(fā)育階段、不同組織的DNA都可用于標記分析；不受環(huán)境因子的影響；檢測手段簡 單、迅速。現(xiàn)有的DNA標記技術有數(shù)十種，但覆蓋馬尾松基因組的比例較小，標記密度較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術問題是：為了克服現(xiàn)有分子標記覆蓋馬尾松基因組比例低、 操作復雜等缺點，本發(fā)明旨在提供多態(tài)性檢出率高、分辨率更好、穩(wěn)定可靠、簡單高效的分 子標記。本發(fā)明提供的IRAP引物及方法，可以使IRAP標記直接用于馬尾松的種質鑒定和 親緣關系分析，具有高效性和實用性。
[0005] 本發(fā)明的技術方案是：一種利用IRAP分子標記對馬尾松種質鑒定的方法，包含以 下步驟： (1) 采用天根DNA secure Plant Kit試劑盒優(yōu)化步驟后，提取基因組DNA ; (2) 根據(jù)馬尾松LTR反轉錄轉座子的序列設計系列IRAP引物，并進行PCR擴增體系優(yōu) 化； (3) 通過瓊脂糖凝膠電泳代替聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟，將譜帶按"引物號-片段長 度"為指紋進行記錄，并按有無分別賦值1和〇,建立數(shù)據(jù)庫。
[0006] IRAP標記引物：為以下中的1條或任意幾條： R-3 GCCCTGAACAAGAAGACACTG ； R-16 AGCGGTATGTGCGTGGACTA ； R-17 AGACCTCAAAGAATCGCTACCC ； P-3 AGGGTAAGAAAGAACTGGTATG ； P-16 AGGGTATGAGGTGAAAGGGAAGG ； SARl CAACTCATACGCAACCTGTCCAATCCTG ； SAF2 GTGGAGCCTGATTATCTTCTAT ； PPT2 ACCAGGGAGAAATTGAGAATCT 〇
[0007] 步驟（2)中10 μ?的反應體系中：10-50 ng的模板DNA、0. 3-0. 5 μ?濃度為1〇μΜ 的引物、ddH20 和 5 μ? Mix。
[0008] Mix包含0· I U/μ I Taq polymerase，500yM dNTP，20 mM Tris-HCl，100 mM KC1， 3 mM MgC12,以及穩(wěn)定劑和增強劑。
[0009] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過馬尾松反轉錄轉座子LTR、PPT及RT序列設計引 物，經(jīng)過簡單的PCR和電泳檢測，可以檢測其它分子標記無法鑒定的馬尾松種質，具有操作 簡單、重復性好、效率高等優(yōu)點。本發(fā)明中開發(fā)的8條IRAP引物擴增獲得的分子標記，在 馬尾松基因組中分布均勻、多態(tài)性豐富、清晰穩(wěn)定、分辨率高，可有效用于馬尾松種質的DNA 指紋圖譜構建及知識產(chǎn)權保護等工作，具有重要實際意義；在本發(fā)明中，優(yōu)化的PCR體系更 適合馬尾松IRAP標記的擴增，而且采用瓊脂糖凝膠電泳代替聚丙烯凝膠電泳，極大地節(jié)省 了時間和成本，進一步提高了 IRAP標記在馬尾松種質鑒定和知識產(chǎn)權保護上的應用效率。
【附圖說明】
[0010] 圖1為IRAP引物擴增后聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖； 圖2為IRAP引物擴增后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖； 圖3為引物SARl對60個馬尾松家系的電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0011] 實施例：以本發(fā)明中的IRAP引物鑒定60份馬尾松種質，其中P-16、SARl、PPT2單 條引物即可區(qū)分所有60份供試材料。
[0012] UIRAP引物設計 以申請人獲得的帶有3'-LTR末端的馬尾松反轉錄轉座子LTR序列和部分RT序列為模 板，設計合成特異的IRAP正、反向引物(表1)。
【主權項】
1. 一種利用IRAP分子標記對馬尾松種質鑒定的方法，其特征在于：包含以下步驟： (1) 采用天根DNAsecurePlantKit試劑盒優(yōu)化步驟后，提取基因組DNA; (2) 根據(jù)馬尾松LTR反轉錄轉座子的序列設計系列IRAP引物，并進行PCR擴增體系優(yōu) 化； (3) 通過瓊脂糖凝膠電泳代替聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟，將譜帶按"引物號-片段長 度"為指紋進行記錄，并按有無分別賦值1和〇,建立數(shù)據(jù)庫。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種利用IRAP分子標記對馬尾松種質鑒定的方法，其特征在 于：IRAP標記引物：為以下中的1條或任意幾條： R-3GCCCTGAACAAGAAGACACTG； R-16 AGCGGTATGTGCGTGGACTA； R-17 AGACCTCAAAGAATCGCTACCC； P-3AGGGTAAGAAAGAACTGGTATG； P-16 AGGGTATGAGGTGAAAGGGAAGG； SARICAACTCATACGCAACCTGTCCAATCCTG ； SAF2 GTGGAGCCTGATTATCTTCTAT； PPT2 ACCAGGGAGAAATTGAGAATCT〇
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種利用IRAP分子標記對馬尾松種質鑒定的方法，其特征在 于：步驟（2)中10m1的反應體系中：1〇_50ng的模板DNA、0. 3-0. 5m1濃度為1〇MM的 引物、ddH20 和 5m1Mix。
4. 根據(jù)權利要求3所述的一種利用IRAP分子標記對馬尾松種質鑒定的方法，其特征 在于：Mix包含 0.1U/illTaqpolymerase，500iiMdNTP，20mMTris-HCl，100mMKC1，3 mMMgCl2，以及穩(wěn)定劑和增強劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用IRAP分子標記對馬尾松種質鑒定的方法，其特征在于：包含以下步驟：（1）采用天根DNA？secure？Plant？Kit試劑盒優(yōu)化步驟后，提取基因組DNA；（2）根據(jù)馬尾松LTR反轉錄轉座子的序列設計系列IRAP引物，并進行PCR擴增體系優(yōu)化；（3）通過瓊脂糖凝膠電泳代替聚丙烯酰胺凝膠電泳步驟，將譜帶按“引物號-片段長度”為指紋進行記錄，并按有無分別賦值1和0，建立數(shù)據(jù)庫。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104561276
【申請?zhí)枴緾N201410795746
【發(fā)明人】文曉鵬, 崔博文, 范付華, 丁貴杰, 張婷, 趙揚
【申請人】貴州大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月22日