油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物及鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物及其鑒定方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002]油茶是我國(guó)栽植面積最大、分布范圍較廣的木本油料樹(shù)種。大力發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，對(duì) 保障糧油安全，促進(jìn)農(nóng)民增收，推進(jìn)山區(qū)綜合開(kāi)發(fā)和建設(shè)社會(huì)主義新農(nóng)村，都具有十分重要 的意義。我國(guó)油茶產(chǎn)業(yè)方興未艾，發(fā)展?jié)摿薮?。目前，我?guó)油茶林總面積達(dá)4500多萬(wàn)畝， 但產(chǎn)量很低，每畝產(chǎn)茶油僅4公斤左右。其根本原因是，絕大部分油茶林品種品質(zhì)差或嚴(yán)重 退化，而大量的國(guó)家和省級(jí)審（認(rèn)）定的優(yōu)良品種又未推廣應(yīng)用。同時(shí)，一些地方種苗質(zhì)量 意識(shí)淡薄，經(jīng)營(yíng)管理粗放。為保障油茶產(chǎn)業(yè)又好又快發(fā)展，要充分認(rèn)識(shí)油茶良種對(duì)發(fā)展油茶 產(chǎn)業(yè)的重要性，必須加快油茶優(yōu)良種苗發(fā)展和強(qiáng)化質(zhì)量管理。
[0003] 我國(guó)目前對(duì)油茶種苗質(zhì)量的監(jiān)督管理，主要依靠在管理層面制定的各項(xiàng)制度，而 在技術(shù)層面尚未取得關(guān)鍵性突破，特別是缺乏油茶良種的早期快速鑒別技術(shù)體系。目前通 過(guò)國(guó)家林木良種審定的12個(gè)長(zhǎng)林品種系列分別為長(zhǎng)林3號(hào)、長(zhǎng)林4號(hào)、長(zhǎng)林18號(hào)、長(zhǎng)林21 號(hào)、長(zhǎng)林23號(hào)、長(zhǎng)林26號(hào)、長(zhǎng)林27號(hào)、長(zhǎng)林40號(hào)、長(zhǎng)林53號(hào)、長(zhǎng)林55號(hào)、長(zhǎng)林56號(hào)、長(zhǎng)林 166號(hào)。這些油茶良種具有早實(shí)豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、出籽率高、含油量高、抗性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)。 對(duì)油茶種苗質(zhì)量的監(jiān)督管理要著力解決目前生產(chǎn)上油茶種苗的混亂局面，并首先從技術(shù)層 面上對(duì)長(zhǎng)林油茶良種進(jìn)行鑒別保護(hù)。
[0004] 目前對(duì)油茶品種的鑒別主要依據(jù)表觀特征，但由于許多形態(tài)性狀鑒定的周期 長(zhǎng)、受環(huán)境影響大，并且品種數(shù)量不斷增多，使得品種鑒定愈來(lái)愈困難。自本世紀(jì)以來(lái)， 一些基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增 多態(tài)性DNA)、ISSR(Inter_Simple Sequence Repea，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性）和 SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）相繼用于油茶 的種質(zhì)資源遺傳多樣性、遺傳距離研宄，但對(duì)于分子標(biāo)記與油茶性狀的連鎖、油茶品種間的 分子鑒別研宄很少，況且這些分子標(biāo)記所采用的均為通用引物，其PCR擴(kuò)增圖譜不僅復(fù)雜、 重復(fù)性差，而且特異性不高，因此并不適合用于品種鑒定，只有開(kāi)發(fā)出某個(gè)品種穩(wěn)定、特異 的DNA指紋標(biāo)記才能真正用于該品種的準(zhǔn)確快速鑒定。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的提供一對(duì)特異性高的油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物，以 及一種能對(duì)油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)進(jìn)行快速鑒定的方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列如下：
[0008]上游引物：5，-AGCGGCCGCGTAATAAGTCTAAGC-3 '，
[0009]下游引物：5，-AGCGGCCGCGITGGATCA-3，。
[0010] 該引物對(duì)是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過(guò)大量篩選試驗(yàn)獲得油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)的特異性 DNA片段之后，將該片段克隆測(cè)序，以得到的DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異性引物，以該特異性 引物對(duì)油茶良種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅長(zhǎng)林18號(hào)可獲得549bp大小的特異性片段，其他油茶品 種均不能獲得特異性片段。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物僅限于油茶良種的 鑒定（鑒定其是否為長(zhǎng)林18號(hào)），即待測(cè)樣品僅限于油茶。
[0011] 本發(fā)明還涉及一種利用所述的分子特異性標(biāo)記引物對(duì)油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)進(jìn)行快 速鑒定的方法，所述方法為：提取待測(cè)油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子 特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果出現(xiàn) 549bp大小的DNA條帶，則待測(cè)油茶品種為油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)，反之則否；所述分子特異性 標(biāo)記引物序列為：
[0012] 上游引物：5，-AGCGGCCGCGTAATAAGTCTAAGC-3'，
[0013] 下游引物：5，-AGCGGCCGCGITGGATCA-3，。
[0014] 本發(fā)明方法關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物的選擇、DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定， 以及電泳檢測(cè)，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。
[0015] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述PCR反應(yīng)體系組成如下：
[0016]
[0017] 余量為 ddlf。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物，所述引物序列如下： 上游引物：5 ' -AGCGGCCGCGTAATAAGTCTAAGC-3'， 下游引物：5' -AGCGGCCGCGTTGGATCA-3'。
2. -種利用權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物對(duì)油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)進(jìn)行快速鑒 定的方法，所述方法為：提取待測(cè)油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性 標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，若電泳結(jié)果出現(xiàn)549bp 的特異DNA條帶，則待測(cè)油茶品種為油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)，反之則否；所述分子特異性標(biāo)記引 物序列為： 上游引物：5 ' -AGCGGCCGCGTAATAAGTCTAAGC-3'， 下游引物：5' -AGCGGCCGCGTTGGATCA-3'。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增條件如下：94°C預(yù)變性4min ; 94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7min，終止溫 度為4°C。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： (1) 取待測(cè)油茶葉片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測(cè)油茶葉片的基因組DNA ; (2) 以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增： PCR反應(yīng)體系每25 μ L組成如下：
CldH2O 補(bǔ)足至 25 μ L ; PCR反應(yīng)條件如下： 94°〇預(yù)變性4!1^11;94°0變性4〇8,60°0退火4〇8,72°0延伸11^11，共30個(gè)循環(huán) ；最后于 72°C補(bǔ)平7min，終止溫度為4°C ; (3) 取步驟（2)擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L，與1 μ L 0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1. 5%的瓊 脂糖凝膠上，于IXTAB緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動(dòng)凝膠圖像 分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)549bp的特異DNA條帶，則待測(cè)油茶品種為長(zhǎng)林18號(hào)，反之 則否。
【專利摘要】一對(duì)特異性高的油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)的分子特異性標(biāo)記引物，以及一種能對(duì)油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)進(jìn)行快速鑒定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCGTAATAAGTCTAAGC-3′，下游引物：5′-AGCGGCCGCGTTGGATCA-3′。本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物可對(duì)油茶良種長(zhǎng)林18號(hào)進(jìn)行快速的早期鑒別，方法簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分子手段。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開(kāi)號(hào)】CN104673790
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410849334
【發(fā)明人】李海波, 王麗玲, 徐梁, 魏海龍
【申請(qǐng)人】浙江省林業(yè)科學(xué)研究院
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2014年12月30日