一種昆蟲(chóng)細(xì)胞色素p450基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因、基因片段及其 dsRNA和dsRNA在致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在我國(guó)，農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展在國(guó)家發(fā)展戰(zhàn)略中具有舉足輕重的作用，農(nóng)業(yè)蟲(chóng) 害的綜合防治是農(nóng)業(yè)植物保護(hù)的重要工作。飛蝗具有迀飛性和暴發(fā)性，蝗災(zāi)是我國(guó)農(nóng)業(yè)歷 史上的重大自然災(zāi)害?；葹?zāi)治理仍主要采取化學(xué)防治方法，殺蟲(chóng)劑的大規(guī)模應(yīng)用對(duì)農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅。在綠色植保的發(fā)展理念的指導(dǎo)下，探索新型環(huán)保的害蟲(chóng)防 治方法成為植物保護(hù)領(lǐng)域的發(fā)展方向。
[0003] 目前，基于RNA干擾（RNA interference, RNAi)的害蟲(chóng)控制方法，已成為新的害蟲(chóng) 防治手段。該技術(shù)利用昆蟲(chóng)自身基因片段，通過(guò)RNAi抑制昆蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育或生化代謝中 關(guān)鍵基因的表達(dá)，以控制害蟲(chóng)為害。該技術(shù)具有抗蟲(chóng)專一性，對(duì)非靶標(biāo)生物無(wú)殺傷作用和對(duì) 環(huán)境無(wú)毒無(wú)害的優(yōu)勢(shì)。
[0004] RNAi常用的導(dǎo)入方法有注射、飼喂、浸泡、組織培養(yǎng)、病毒感染、轉(zhuǎn)基因等。利用 RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)的可行性已被證實(shí)，2007年發(fā)表于Nature Biotechnology中的兩篇學(xué) 術(shù)論文報(bào)道了該領(lǐng)域進(jìn)展。已成功培育出dsRNA轉(zhuǎn)基因玉米和棉花植株，誘導(dǎo)特異性RNAi 反應(yīng)，達(dá)到了防治害蟲(chóng)的目的（Baum et al，2007;Mao et al，2007)。研宄表明，RNA干擾技 術(shù)能夠有效控制害蟲(chóng)，在農(nóng)業(yè)植保防治領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。而實(shí)現(xiàn)基于RNAi害蟲(chóng)有 效控制的關(guān)鍵問(wèn)題是篩選害蟲(chóng)特異性和高效致死作用的dsRNA。
[0005] 昆蟲(chóng)表皮脂類主要成分為碳?xì)浠衔铩⒋技跋炛?，其可防止昆蟲(chóng)體內(nèi)水分的過(guò) 分蒸發(fā)，同時(shí)在昆蟲(chóng)防御、生殖及通訊等方面也發(fā)揮著重要作用，因此抑制昆蟲(chóng)表皮脂類合 成可達(dá)到害蟲(chóng)防治的目的。細(xì)胞色素P450單氧化酶基因CYP4G102主要負(fù)責(zé)飛蝗表皮脂類 物質(zhì)的合成，由于CYP4G基因是昆蟲(chóng)所特有的，故采用該基因開(kāi)展基于RNAi的害蟲(chóng)防治應(yīng) 用是安全的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因、基因片段及其dsRNA和 dsRNA在致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的一種昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因（全長(zhǎng)序列），其核苷酸序列是SEQ ID NO :1，序列長(zhǎng)度為1686bp ;氨基酸序列是SEQ ID NO :2,序列長(zhǎng)度為561aa。
[0008] 本發(fā)明提供的一種昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO :3。
[0009] 本發(fā)明提供的一種昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因片段的獲得的方法，包括如下步驟：對(duì) 飛蝗細(xì)胞色素P450基因（CYP4G102)氨基酸序列分析后，選擇細(xì)胞色素P4504G家族的特征 區(qū)域，設(shè)計(jì)上游引物SEQ ID N0:4和下游引物SEQ ID N0:5,以含有核苷酸序列SEQ ID NO: 1的質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得SEQ ID NO :3的DNA片段，該片段含有17啟動(dòng)子，核苷 酸序列長(zhǎng)度為443bp。
[0010] 進(jìn)一步，以SEQ ID NO :3的DNA片段為模板，利用試劑盒合成dsRNA(dsCYP4G102)。
[0011] SEQ ID NO :3合成的dsRNA(簡(jiǎn)稱為dsCYP4G102)在致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用：注射上述 dsRNA到昆蟲(chóng)體腔，結(jié)果表明：SEQ ID勵(lì)：3合成的(1成隱可以特異性地沉默飛蝗細(xì)胞色素 P450基因CYP4G102的mRNA表達(dá)，導(dǎo)致飛蝗體壁保水性能減弱，體內(nèi)水分過(guò)度散失而死亡。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1 :飛蝗2齡若蟲(chóng)注射dsRNA 24h后，細(xì)胞色素P450(LmCYP4G102)基因的mRNA 表達(dá)情況。0 -actin為內(nèi)參基因，#P〈0. 01 (dsGFP :注射dsGFP的對(duì)照組，dsCYP4G102 :注 射dsCYP4G102的實(shí)驗(yàn)組）。
[0013] 圖2 :飛蝗2齡若蟲(chóng)注射dsRNA后對(duì)若蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響。注射dsCYP4G102的實(shí) 驗(yàn)組若蟲(chóng)在蛻皮至3齡后不久便死亡，蟲(chóng)體出現(xiàn)失水皺縮（圖2A)、變脆易碎（圖2B)的表 型。（dsGFP :注射dsGFP的對(duì)照組，dsCYP4G102 :注射dsCYP4G102的實(shí)驗(yàn)組）。
[0014] 圖3 :飛蝗2齡若蟲(chóng)注射dsRNA后，蛻皮至3齡時(shí)若蟲(chóng)體重的比較。注射 dsCYP4G102的實(shí)驗(yàn)組若蟲(chóng)蛻皮死亡后體重明顯減輕。***代表兩組之間體重差異極顯著 (P〈0. 0001，T-test) (dsGFP :注射 dsGFP 的對(duì)照組，dsCYP4G102 :注射 dsCYP4G102 的實(shí)驗(yàn) 組）。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1 :飛蝗細(xì)胞色素P450基因cDNA全長(zhǎng)序列的獲得
[0016] 基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，采用生物信息學(xué)方法對(duì)飛蝗細(xì)胞色素P450基因進(jìn)行搜 索，經(jīng)過(guò)序列分析，獲得相關(guān)基因部分序列。通過(guò)cDNA末端快速克隆PCR技術(shù)，獲得飛蝗細(xì) 胞色素P450基因（LmCYP4G102) cDNA全長(zhǎng)序列，核苷酸序列長(zhǎng)度為1686bp，編碼561個(gè)氨基 酸。
[0017] 實(shí)施例2 :飛蝗細(xì)胞色素P450基因片段及其dsRNA的獲得
[0018] 1)飛蝗細(xì)胞色素P450基因片段的獲得
[0019] 根據(jù)細(xì)胞色素P4504G家族特征區(qū)域的序列，采用primer premier 5. 0軟件設(shè)計(jì) 特異性引物，上游引物序列為SEQ ID NO :4,下游引物序列為SEQ ID NO :5,所有引物均由生 工生物工程（上海）股份有限公司合成。以含有SEQ ID NO: 1的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲 得飛幢細(xì)胞色素 P450 基因片段，用Wizardl;SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega) 試劑盒將所獲飛蝗細(xì)胞色素P450基因片段進(jìn)行純化。
[0020] 2)飛蝗細(xì)胞色素P450基因片段dsRNA的合成
[0021] 以1)步驟獲得的飛蝗細(xì)胞色素P450基因片段SEQ ID NO :3為模板， 按照T7RiboMAX?Express RNAi System (Promega)試劑盒說(shuō)明書(shū)，體外轉(zhuǎn)錄合 成dsRNA (dsCYP4G102)。得到的dsRNA用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其單一性，用 NANODROP (Thermo Scientific, USA)將其定量至終濃度為2 y g/ y L，保存至-80°C冰箱備 用。
[0022] 實(shí)施例3 :細(xì)胞色素P450基因片段合成的dsRNA致死飛蝗實(shí)驗(yàn)
[0023] 1、飛蝗細(xì)胞色素P450基因CYP4G102片段合成的dsRNA注射
[0024] 選取飛蝗2齡第2天大小均一、健康狀況一致的若蟲(chóng)，設(shè)置注射dsGFP的對(duì)照組和 注射SEQ ID NO:3的dsRNA(dsCYP4G102)的實(shí)驗(yàn)組。采用微量注射器將體外合成的dsRNA 注射至若蟲(chóng)體腔，dsRNA的注射量為4yg/頭，每組各60頭若蟲(chóng)，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。注 射完畢后，將若蟲(chóng)置于紗籠中放于人工氣候箱中飼養(yǎng)（光照：黑暗時(shí)間=14h:10h，溫度 30±2°C，濕度60% )，給以新鮮小麥幼苗喂食。
[0025] 2、飛蝗細(xì)胞色素P450基因沉默效率檢測(cè)
[0026] 取注射dsRNA 24h后的若蟲(chóng)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均取12頭，雌雄各半，設(shè)置3個(gè)生 物學(xué)重復(fù)。Trizol法提取總RNA，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶獲得第一鏈cDNA，以此為模板進(jìn)行 Real-time PCR，檢測(cè)目的基因（LmCYP4G102)和內(nèi)參基因（0-actin)的相對(duì)表達(dá)量，以計(jì) 算目的基因的沉默效率。結(jié)果表明該基因的沉默效率達(dá)90% (圖1)。
[0027] 3、注射dsRNA后飛蝗表型的觀察
[0028] 2齡若蟲(chóng)注射dsRNA后，對(duì)照組與注射dsCYP4G102實(shí)驗(yàn)組的若蟲(chóng)在取食量、體型變 化及體重增長(zhǎng)方面并無(wú)顯著差異，而且均可順利蛻皮至3齡，但dsCYP4G102注射組若蟲(chóng)在 蛻至3齡后不久（約20min)便死亡，放置一段時(shí)間后（約3-4h)，蟲(chóng)體出現(xiàn)失水皺縮的表 型，極易破碎（圖2A-B)。此時(shí)，將對(duì)照組與注射dsCYP4G102實(shí)驗(yàn)組的3齡若蟲(chóng)按雌雄分 類，稱量體重進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)dsCYP4G102注射組若蟲(chóng)體重明顯減輕（圖3)。
[0029] 4、注射dsRNA后飛蝗死亡情況統(tǒng)計(jì)
[0030] 注射dsCYP4G102的飛蝗實(shí)驗(yàn)組死亡率為100 %。這與注射dsGFP的對(duì)照組（死亡 率為〇% )相比，致死效果明顯。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種昆蟲(chóng)細(xì)胞色素 P450基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO :1。
2. -種昆蟲(chóng)細(xì)胞色素 P450基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO :3。
3. -種昆蟲(chóng)細(xì)胞色素 P450基因片段的獲得方法，包括如下步驟：以含有核苷酸序列 SEQ ID NO: 1的質(zhì)粒為模板，用上游引物SEQ ID NO :4和下游引物SEQ ID NO :5進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，得到的產(chǎn)物經(jīng)Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)試劑盒純 化后，獲得核苷酸序列是SEQ ID NO :3的基因片段。
4. 一種昆蟲(chóng)細(xì)胞色素 P450基因片段的dsRNA的合成方法，包括如下步驟：將權(quán) 利要求3獲得的核苷酸序列SEQ ID NO :3的基因片段，按照T7 RiboMA Express RNAi System(Promega)試劑盒說(shuō)明書(shū)，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。
5. 如權(quán)利要求4所述方法合成的昆蟲(chóng)細(xì)胞色素 P450基因片段的dsRNA。
6. 如權(quán)利要求5所述的昆蟲(chóng)細(xì)胞色素 P450基因片段的dsRNA在致死飛蝗中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因及其應(yīng)用，包括昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因、基因片段及其dsRNA和dsRNA在致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用。首先對(duì)飛蝗的細(xì)胞色素P450基因進(jìn)行克隆、測(cè)序后，獲得CYP4G102基因，其核苷酸全長(zhǎng)序列為SEQ ID NO：1，氨基酸序列為SEQ ID NO：2。而后獲得序列為SEQ ID NO：3的該基因片段，由該片段合成dsRNA。將上述合成的dsRNA注入飛蝗體腔后，此種昆蟲(chóng)因蛻皮后體壁保水性能減弱，導(dǎo)致體內(nèi)水分過(guò)度散失而死亡，死亡率達(dá)到100％。本發(fā)明為基于RNA干擾的害蟲(chóng)防治提供分子靶標(biāo)，可用于害蟲(chóng)防治。
【IPC分類】A01N57-16, C12N15-10, A01P7-04, C12N15-53, C12N15-113
【公開(kāi)號(hào)】CN104673812
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510118799
【發(fā)明人】余志濤, 張學(xué)堯, 劉耀明, 張建珍, 馬恩波
【申請(qǐng)人】山西大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月18日