豬rbp4蛋白體外表達及其抗體制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬RBP4蛋白的體外表達及其抗體的制備。
【背景技術(shù)】
[0002] 視黃醇結(jié)合蛋白（Retinol-Binding Proteins，RBPs)是體內(nèi)一種低分子量的載脂 蛋白，有四種結(jié)構(gòu)形式，分別為RBP-l、RBP-2、RBP-3和RBP4。其中RBP4是一種主要在肝臟 表達的轉(zhuǎn)運蛋白，主要作用是結(jié)合和轉(zhuǎn)運VitaminA(VA)。隨著對其功能的深入研宄，發(fā)現(xiàn) 許多肝臟外組織也能合成RBP4,如大鼠的卵黃囊，豬、綿羊和奶牛的孕體、子宮、胎盤組織， 并且Harney等研宄表明，子宮中RBP4的表達水平可能受激素的調(diào)節(jié)。目前研宄表明，RBP4 在家畜生產(chǎn)性能，尤其在豬繁殖性能方面具有重要意義，已經(jīng)成為母豬高產(chǎn)仔數(shù)的理想候 選基因。研宄報道，RBP4基因存在兩種基因型，基因型之間的差異為0.5頭/窩（總產(chǎn)仔 數(shù)）和0.26頭/窩（產(chǎn)活仔數(shù)）。我國學者在一些地方豬種中也發(fā)現(xiàn)了顯著影響豬總產(chǎn)仔 數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的RBP4基因型。RBP4基因除了與繁殖性狀相關(guān)以外，也能直接影響動物的胚 胎發(fā)育。用siRNA干擾技術(shù)抑制小鼠RBP4合成后，導致胚胎卵黃血管、腦神經(jīng)血管和眼部 畸形，然而，添加外源RBP4后胚胎發(fā)育恢復正常，說明，RBP4在胚胎發(fā)育過程中具有重要的 調(diào)節(jié)作用。因此，豬RBP4蛋白體外表達及制備特異性結(jié)合豬RBP4蛋白的抗體具有重要的 意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供豬RBP4蛋白體外表達及其抗體制備。
[0004] 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0005] 一種豬RBP4蛋白體外表達的方法，獲得豬RBP4目的基因，將豬RBP4目的基因與 表達載體重組后轉(zhuǎn)化表達宿主菌，誘導豬RBP4蛋白的表達。
[0006] 在一些實施方案中，所述豬RBP4目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 在一些實施方案中，所述表達載體為pEASY-El。
[0008] 在一些實施方案中，所述表達宿主菌為BL21 (DE3) pLySs。
[0009] 在一些實施方案中，所述誘導為宿主菌培養(yǎng)后加入IPTG至終濃度為lmmol/L。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種制備豬RBP4蛋白的抗體的方法，以豬RBP4蛋白為抗原免疫 家兔獲得豬RBP4蛋白多克隆抗體血清。
[0011] 在一些實施方案中，所述豬體RBP4蛋白為豬RBP4目的基因體外表達后經(jīng)純化、復 性得到。
[0012] 在一些實施方案中，所述體外表達為原核表達。
[0013] 在一些實施方案中，所述純化為鎳柱親和層析純化。
[0014] 在一些實施方案中，所述復性為尿素溶液透析復性。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述制備方法制備的豬RBP4蛋白抗體。
[0016] 本發(fā)明通過Western Blot實驗驗證所述抗體的特異性，結(jié)果顯示本發(fā)明所述豬 RBP4蛋白抗體特異性好，能夠特異性豬肝臟組織蛋白和純化的豬RBP4蛋白。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述豬RBP4蛋白抗體在制備用于檢測豬RBP4蛋白的免疫檢測工 具中的應用。
[0018] 具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。
[0019] 在具體的實施例中，本發(fā)明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述豬RBP4蛋 白抗體，可檢測組織細胞中RBP4的表達狀況。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種豬RBP4蛋白體外表達的方法以及以表達的 蛋白制備豬RBP4蛋白抗體的方法。本發(fā)明所述豬RBP4蛋白抗體可與豬肝臟組織蛋白和純 化的豬RBP4蛋白特異性結(jié)合，特異性好，廣泛適用于各種檢測豬RBP4蛋白的免疫檢測工 具。
【附圖說明】
[0021] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0022] 圖1示實施例1RBP4基因PCR電泳結(jié)果，其中泳道M為2000bp marker，泳道1為 RBP4基因PCR電泳結(jié)果；
[0023] 圖2示實施例110% SDS-PAGE電泳分析結(jié)果圖，其中泳道M為蛋白marker、泳道 1為BL21 (DE3)pLysS空菌體、泳道2為常規(guī)LB培養(yǎng)的含表達載體的BL21 (DE3)pLysS菌體 未誘導組、泳道3為添加1%葡萄糖LB培養(yǎng)的含表達載體的BL21 (DE3)pLysS未誘導組、泳 道 4-5 為含 pEASY-El-RBP4 的 BL21 (DE3)pLysS 誘導后上清、泳道 6-7 為含 pEASY-El-RBP4 的BL21 (DE3)pLysS誘導后沉淀；
[0024] 圖3示實施例2Western Blot分析結(jié)果，其中泳道1為實施例1獲得的包涵體蛋 白、泳道2為不含表達載體的空菌破碎沉淀、泳道3為含表達載體未誘導組破碎沉淀；
[0025] 圖4示實施例3純化蛋白的10% SDS-PAGE電泳分析結(jié)果圖，其中泳道M為蛋白 marker，泳道1和2為純化蛋白；
[0026] 圖5示實施例4復性蛋白的10% SDS-PAGE電泳分析結(jié)果圖，其中泳道M為廣譜彩 虹預染marker，泳道1為復性蛋白；
[0027] 圖6示實施例4復性蛋白的Western Blot分析結(jié)果，其中泳道1為透析復性蛋白 1，泳道2為透析復性蛋白2;
[0028] 圖7示實施例6以實施例4透析復性后的RBP4蛋白進行豬卵泡顆粒細胞體外添 加實驗的MTT檢測結(jié)果圖，其中橫坐標為添加的透析復性后的RBP4蛋白的濃度；縱坐標為 細胞活力；
[0029] 圖8示實施例8以實施例3純化的RBP4蛋白為抗原，以實施例7制備的抗體為一 抗Western Blot檢測的結(jié)果圖，其中泳道1為純化蛋白，泳道2為空白對照；
[0030] 圖9示實施例8以豬肝臟組織蛋白為抗原，以實施例7制備的抗體為一抗Western Blot檢測的結(jié)果圖，其中泳道1為豬肝臟組織蛋白1，泳道2為豬肝臟組織蛋白2。
【具體實施方式】
[0031] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0032]實施例1、豬RBP4蛋白體外表達
[0033] l、Trizol法提取正常成年母豬卵巢組織總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄。
[0034]2、豬RBP4基因CDS序列擴增：
[0035]豬 RBP4 基因606bp，序列如 SEQID NO.1 所示。
[0036]擴增引物：F: 5，-ATGGAATGGGITTGGGC-3'，
[0037] R: 5' -CTACAAAATGTTTCTTTCCGAT-3'
[0038] PCR過程：
[0039]
【主權(quán)項】
1. 一種豬RBP4蛋白體外表達的方法，獲得豬RBP4目的基因，將豬RBP4目的基因與表 達載體重組后轉(zhuǎn)化表達宿主菌，誘導豬RBP4蛋白的表達。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述豬RBP4目的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 不〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述表達載體為pEASY-El。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的方法，所述表達宿主菌為BL21 (DE3)pLySs。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的方法，所述誘導為宿主菌培養(yǎng)后加入IPTG至終濃 度為 lmmol/L。
6. -種制備豬RBP4蛋白的抗體的方法，以豬RBP4蛋白為抗原免疫家兔獲得豬RBP4蛋 白多克隆抗體血清。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述豬體RBP4蛋白為豬RBP4目的基因體外表達后經(jīng) 純化、復性得到。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述體外表達為原核表達。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，所述純化為鎳柱親和層析純化。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6-9任意一項所述的方法，所述復性為尿素溶液透析復性。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種豬RBP4蛋白體外表達的方法以及以表達的蛋白制備豬RBP4蛋白抗體的方法。本發(fā)明所述豬RBP4蛋白抗體可與豬肝臟組織蛋白和純化的豬RBP4蛋白特異性結(jié)合，特異性好，廣泛適用于各種檢測豬RBP4蛋白的免疫檢測工具。
【IPC分類】C12N15-70, C12N15-12, C07K16-18
【公開號】CN104673818
【申請?zhí)枴緾N201510133999
【發(fā)明人】孫麗娜, 周虛, 陳璐, 李純錦, 趙云, 陳樹雄, 劉卓, 李萬宏, 李洪蛟, 于佳鑫, 王昊天, 劉亞亭, 王鳳鴿, 高珊, 蔣彥文
【申請人】吉林大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月25日