結(jié)合丁型肝炎病毒的核酸適配子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程與生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明涉及利用SELEX技術(shù)篩選獲得的 一種靶向感染丁型肝炎病毒肝細(xì)胞的核酸適配子，以及此適配子的核苷酸序列。
【背景技術(shù)】
[0002] 丁型肝炎病毒HDV感染是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞肝癌的重要原因之一， HDV感染呈世界性分布，但主要分布于南意大利和中東等地區(qū)。其傳播方式主要通過(guò)輸血或 使用血制品，也可通過(guò)密切接觸與母嬰間垂直感染等方式傳播。高危人群包括藥癮者及多 次受血者。近年來(lái)，在我國(guó)發(fā)病率也有一定的增長(zhǎng)趨勢(shì)。因此，針對(duì)丁型肝炎的防治研究一 直是我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生科研的重要領(lǐng)域。雖然國(guó)內(nèi)丁肝疫苗的計(jì)劃免疫大大降低了丁肝的發(fā)病 率，但是對(duì)已經(jīng)存在的HDV慢性感染仍缺乏長(zhǎng)期有效的抗病毒藥物，且大多數(shù)藥物并非特 異性作用于肝臟。將藥物與肝臟靶向性載體結(jié)合，使其選擇性靶向到特定的肝細(xì)胞，從而使 藥物更高效地傳遞到肝臟、更好地發(fā)揮藥物的治療作用是極具前景的治療方案。HDV感染肝 細(xì)胞后能夠在感染細(xì)胞表面表達(dá)病毒的表面抗原，利用表面作為靶子，將治療藥物運(yùn)送到 感染細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用是非常有前景的一種治療設(shè)想。
[0003] SELEX技術(shù)（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment) 是20世紀(jì)90年代初-發(fā)展起來(lái)的一種新的組合化學(xué)技術(shù)。寡核苷酸適配子是由SELEX技 術(shù)篩選獲得的，該技術(shù)的原理就是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷 酸文庫(kù)，其隨機(jī)序列長(zhǎng)度在20-100個(gè)堿基左右。利用單鏈寡核苷酸分子構(gòu)像靈活多變的特 性，將隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶分子相互作用，保留以空間構(gòu)像與靶分子結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng) 反復(fù)擴(kuò)增、篩選數(shù)個(gè)循環(huán)，即可使與該靶子特異結(jié)合的寡核苷酸序列得到富集，最終獲得多 種革G分子的特異寡核苷酸適配子，即aptamer。利用SELEX技術(shù)篩選獲得的aptamer識(shí)別分 子的模式與蛋白抗體類似，但與蛋白類抗體相比，核酸類配基具有更多的優(yōu)越性，如不受免 疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復(fù)性可逆，可修飾并有利于長(zhǎng)期保存和室 溫運(yùn)輸?shù)?。更重要的是，aptamer比抗體具有更高的特異性，甚至能識(shí)別單抗不能區(qū)分的蛋 白質(zhì)分子。而且aptamer的靶分子非常廣泛，小至染料分子，大至完整的病毒顆粒和細(xì)菌病 原體，甚至完整的細(xì)胞也可以通過(guò)消減SELEX技術(shù)篩選出高親和力的寡核苷酸適配子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種RNA適配子，通過(guò)特異性結(jié)合肝臟中感染丁型肝炎病毒 的肝細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)丁肝治療藥物運(yùn)送的靶向性，可用于慢性丁型肝炎的診斷與治療。
[0005] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 體外合成一個(gè)含有37個(gè)隨機(jī)序列的單鏈DNA文庫(kù)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建出單鏈RNA適 配子隨機(jī)文庫(kù)；采用酵母表達(dá)的方法體外表達(dá)丁型肝炎病毒表面蛋白，以其為靶蛋白，采 用SELEX技術(shù)篩選具有高親和力的表面抗原特異性RNA適配子；通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件RNA StructureProgram分析預(yù)測(cè)適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)膜結(jié)合測(cè)定實(shí)驗(yàn)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)鑒定 篩選適配子對(duì)靶蛋白的特異性和親和力，得到了多個(gè)與表面抗原親和力高、特異性強(qiáng)的適 配子。所述的適配子都能形成各自的特異莖環(huán)結(jié)構(gòu)。所述適配子能特異性、高親和力地結(jié) 合丁型肝炎病毒表面蛋白或靶向結(jié)合至感染丁型肝炎病毒的肝細(xì)胞。ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)該適 配子能特異競(jìng)爭(zhēng)丁型肝炎病毒表面抗原與抗體的結(jié)合。所述適配子序列如下： DG-H02：AGTCGACCTTGCAATGAGTGAATGTTATAACACATCACACCATCTCATCATCTACGCTCGCATGGA ATTTGCAACTGCC DG-H03：AGTCGACCTTGCAATGAGTGATGTTATATATTACTTCTTCATGTCATAATACCATCCTCGCATGGA ATTTGCAACTGCC DG-H06：AGTCGACCTTGCAATGAGTGATTATAGACACATCACACCATCGTCATCATCTACCTTTCGCATGGA ATTTGCAACTGCC DG-H07：AGTCGACCTTGCAATGAGTGATAGTATATTACTTCTTCATGTCATAATACCATCCTAACGCATGGA ATTTGCAACTGCC DG-H09：AGTCGACCTTGCAATGAGTGAATAGACACATCACACCAGTCTCATCATCTACCTTTATCGCATGGA ATTTGCAACTGCC DG-H15：AGTCGACCTTGCAATGAGTGATATGATTACTTCTTCATTCATAGATACCATCCTAATACGCATGGA ATTTGCAACTGCC DG-H19：AGTCGACCTTGCAATGAGTGAAGACACATCACACCATCTCATCATCTACGCTTTATAACGCATGGA ATTTGCAACTGCC DG-H21：AGTCGACCTTGCAATGAGTGATATTACTGTCTTCATTCATAATACCATCCTAATAGACCGCATGGA ATTTGCAACTGCC DG-H29：AGTCGACCTTGCAATGAGTGACACGATCACACCATCTCATCATCTACGCTTTATAACACGCATGGA ATTTGCAACTGCC DG-H33：AGTCGACCTTGCAATGAGTGATGTACTTCTTCATTCATAGATACCATCCTAATAACTTCGCATGGA ATTTGCAACTGCC DG-H45：AGTCGACCTTGCAATGAGTGACAGTCACACCATCTCATCATCTACCTTGTATAACACTCGCATGGA ATTTGCAACTGCC〇
[0006] 本發(fā)明的有益效果：（1)獲得了一種能夠特異高效結(jié)合丁型肝炎病毒表面抗原的 適配子。該適配子可以大量人工制備，方法簡(jiǎn)單，成本低廉。（2)以核酸適配子為基礎(chǔ)可以 制備成為靶向慢性丁型肝炎診斷和治療藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0007] 實(shí)施例IHiAg蛋白特異性結(jié)合RNA適配子的SELEX篩選 采用本領(lǐng)域常規(guī)的丁型肝炎蛋白表達(dá)的方法。根據(jù)提取得到的丁型肝炎病毒，提取RNA，經(jīng)RT-PCR與PCR，獲得全長(zhǎng)cDNA，采用酵母表達(dá)的方法體外表達(dá)丁型肝炎病毒蛋白，獲 得了相應(yīng)的蛋白，命名為HiAg。
[0008] 化學(xué)合成初始寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)及引物，序列如下：（5'-AGTCGACCTTGCAAT GAGTGA--N37--CGCATGGAAITTGCAACTGCC-3')，其中N37 為 37 個(gè)隨機(jī)寡核苷 酸； 引物PI:AGTCGACCTTGCAATGAGTGA; 引物P2 :GGCAGTTGCAAATTCCATGCG。
[0009] 將單鏈DNA文庫(kù)擴(kuò)增為雙鏈DNA，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以 回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫(kù)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。70ygRNA 文庫(kù)經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ugHiAg37°C孵育30min， 反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過(guò)，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液（6mol/L尿素， 0. 6mol/L醋酸銨，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸4min，離心，取上清，無(wú)水乙醇沉 淀RNA，并重新溶解于20y1DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄 出RNA文庫(kù)用于下一輪篩選；每輪篩選過(guò)程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫(kù)，以該雙鏈DNA為 模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫(kù)，篩選共進(jìn)行10輪。
[0010] 實(shí)施例2特異性高親和力的HiAg結(jié)合適配子的獲得 將RNA適配子分別取1.5iig，用牛小腸堿性磷酸酶（CIP) 37°C消化lh，純化回收 去磷酸化的RNA;通過(guò)T4多核苷酸激酶標(biāo)記[y_32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。 lOnmol放射性標(biāo)記的RNA適配子分別與不同濃度（l-200nM)的HiAg37°C孵育30min， 各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過(guò)，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定濾膜上殘留的放射 量，同一樣品平行做兩次測(cè)定。計(jì)算各個(gè)適配子與HiAg的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種識(shí)別丁型肝炎病毒寡核苷酸序列，其特征在于：采用SELEX技術(shù)篩選獲得。
2. 如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸序列，其特征在于為其序列為SEQIDNo. 1-12任一條 序列所示。
3. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所示的寡核苷酸序列在篩選丁型肝炎病毒的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所示的寡核苷酸序列用于制備篩選丁型肝炎病毒的試劑盒應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向人感染丁型肝炎病毒的核酸適配子及其序列，屬于基因工程與生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明應(yīng)用新的組合化學(xué)技術(shù)SELEX，以丁型肝炎病毒蛋白為靶蛋白，從單鏈RNA隨機(jī)文庫(kù)中篩選出了能與丁型肝炎病毒表面抗原特異性結(jié)合的RNA適配子。所述適配子在其隨機(jī)序列區(qū)域能形成特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能特異性、高親和力地結(jié)合丁型肝炎病毒表面抗原或靶向結(jié)合至感染丁型肝炎病毒的肝細(xì)胞。該RNA適配子為丁肝診療領(lǐng)域提供了一種特異高效的標(biāo)記分子，并為開(kāi)發(fā)丁型肝炎診斷試劑與治療藥物提供了新的選擇。
【IPC分類】C12N15-115, A61K47-26
【公開(kāi)號(hào)】CN104694544
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510129519
【發(fā)明人】劉紅衛(wèi)
【申請(qǐng)人】劉紅衛(wèi)
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年3月24日