道地黃芪固氮菌新菌株t21及發(fā)酵液的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物固氮細(xì)菌的利用領(lǐng)域，具體地說是涉及一種道地中藥黃芪固氮菌 t21及發(fā)酵液的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，全球種植業(yè)過分依賴和大量施用化肥造成的肥料浪費(fèi)、土壤和地下水污 染以及生態(tài)失衡已經(jīng)引起了世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。減少化肥的使用、提高氮肥利用率是當(dāng) 前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中急需解決的重要問題。充分發(fā)揮固氮細(xì)菌的生物固氮作用是減少氮肥使用量 最有效的途徑，生物固氮資源的研宄、開發(fā)和利用在我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中占有重要地位。 生物固氮是自然界中僅次于光合作用的復(fù)雜生物反應(yīng)系統(tǒng)，為全球的植物提供了大約75% 的氮素。生物固氮在提高土壤肥力、增強(qiáng)植物抗病能力等方面也發(fā)揮著極其重要的作用。
[0003] 固氮細(xì)菌根據(jù)其生活習(xí)性可分為自身固氮菌、聯(lián)合固氮菌和共生固氮菌三類。自 身固氮菌是指在自由生活狀態(tài)下能夠固氮的細(xì)菌，其種類不多，分布很廣，如圓褐固氮菌和 拜葉林克氏固氮菌。聯(lián)合固氮菌是指定植于植物根表和近根土壤中，有的能侵入表皮和外 皮層的細(xì)胞間隙，靠根系分泌物生存、繁衍，與植物根系有密切的關(guān)系的固氮細(xì)菌，如雀稗 固氮菌和產(chǎn)脂固氮螺菌。共生固氮菌的細(xì)菌只有根瘤菌一類，其廣泛存在于土壤中，浸染豆 科植物根部形成根瘤，能將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨提供給植物。上述三類固氮菌中，自身固 氮菌由于其固氮效率低，且固氮特殊，不適合在農(nóng)業(yè)方面廣泛應(yīng)用，所以目前農(nóng)業(yè)方面主要 應(yīng)用聯(lián)合固氮菌和共生固氮菌。
[0004] 黃苗Bunge)是豆科黃苗屬多年生草本植物，又名綿 芪。在我國(guó)產(chǎn)于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、黑龍江等地。黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保肝、利尿、 抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和較廣泛的抗菌作用，作為藥用已有2000多年的歷史。由于長(zhǎng)期大 量采挖，近幾年來野生黃芪的數(shù)量急劇減少，有趨于絕滅的危險(xiǎn)。在黃芪種植過程中，各項(xiàng) 農(nóng)資投入中化肥尤其是氮肥所占比重很大，其對(duì)黃芪的產(chǎn)量和活性成分聚集的影響也最顯 著。而黃芪作為豆科植物，其根際土壤中也共生有大量固氮菌，發(fā)揮著重要的固氮作用。山 西渾源縣是中藥材黃芪的產(chǎn)地。得益于當(dāng)?shù)厮?，渾源所產(chǎn)黃芪甲甙、多糖等含量均為國(guó)內(nèi) 之首，并于2011年獲批國(guó)家地理標(biāo)志證明商標(biāo)"正北芪"。根據(jù)渾源道地黃芪的正宗藥用性 和原產(chǎn)地有用成份這一地理標(biāo)識(shí)產(chǎn)物，以其原生地土壤根瘤菌為研宄基礎(chǔ)，對(duì)道地黃芪的 固氮根瘤菌進(jìn)行分離，篩選和鑒定，并對(duì)其培養(yǎng)條件和生理生化以及生物信息學(xué)方面進(jìn)行 研宄。該研宄為利用生物固氮在黃芪生產(chǎn)上實(shí)現(xiàn)節(jié)肥減耗、加強(qiáng)黃芪種植業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的良 性循環(huán)提供科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的是提供一株道地黃芪固氮菌t21及發(fā)酵液的制備方法，該發(fā)酵液具有非 常明顯的固氮作用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一株道地黃苗固氮菌（5'//?〇_/^辦〇/^'?7?8口.九21菌株于2014年9月18日保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，分類命名為中華根瘤菌（sp.)， 保藏號(hào)為CGMCC No. 9677,地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研 宄所。
[0006] 所述的道地黃苗固氮菌（sp.)新菌株t21是從山西省渾源地區(qū)的 黃芪生長(zhǎng)土壤為材料分離得到的根瘤細(xì)菌。
[0007] 將道地黃芪固氮菌新菌株t21在Ashby無氮培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落形態(tài)呈圓形，無色透 明（見圖1)。在YMA固體培養(yǎng)基上（由YMA液體培養(yǎng)基添加1. 5%瓊脂制成培養(yǎng)平板）生長(zhǎng) 較快，菌落成粘稠狀易流動(dòng)。革蘭氏染色，顯示新菌株t21為革蘭氏陰性桿菌，無芽孢(見圖 2);蘇丹黑B染色呈陽(yáng)性，可見菌體內(nèi)有黑色著色點(diǎn)，為菌體內(nèi)的PHB顆粒（見圖3);孔雀 綠染色呈陰性，提示B圖中的著色點(diǎn)不是細(xì)胞內(nèi)芽胞所致（見圖4)。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng) 鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株t21進(jìn)行了生理生化鑒定，其特征見表1。
[0008] 表1菌株t21的生理生化特征
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株道地黃苗固氮菌（sp.)新菌株t21于2014年9月18日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 9677。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的道地黃苗固氮菌（sp.)新菌株t21，其特征 在于，道地黃苗固氮菌sp.)新菌株t21是從山西省大同市渾源縣黃苗基 地土壤中分離得到的細(xì)菌；將道地黃苗固氮菌（SiflorAizoAiw? sp. H21在YMA培養(yǎng)基上生 長(zhǎng)較快，菌成粘稠狀易流動(dòng)，革蘭氏陰性，菌體呈短桿狀，無芽孢，有PHB顆粒；根據(jù)《常見細(xì) 菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株t21進(jìn)行了生理生化鑒定，結(jié)果如下表所示： 本發(fā)明新菌株t21的生理生化特征
注：+表示呈陽(yáng)性反應(yīng)；一表示呈陰性反應(yīng). 提取新菌株t21的DNA，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增其16S rRNA序列，測(cè)序后獲得序列1309bp， 將其序列在 NCBI 網(wǎng)站 Blast 比對(duì)，t21 菌株與 sp. SCAUS141 的 16S rRNA 基因序列同源性為99% (KF836038)，結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)，確定新菌株t21為 Sinorhizobium sp. 〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的道地黃芪固氮菌新菌株t21，其發(fā)酵液的制備方法包括如下 步驟： (1) 種子液制備從試管斜面上用接種針挑取菌株t21到斜面培養(yǎng)基上，恒溫28°C培 養(yǎng)24h后接種到裝有IOOmL的LB培養(yǎng)液的三角瓶中，180r/min振蕩培養(yǎng)12h，制得道地黃 芪固氮菌新菌株t21的種子液； (2) 發(fā)酵液制備將解淀粉芽孢桿菌新菌株t21的種子液按照1%的比例接入發(fā)酵培養(yǎng) 基，培養(yǎng)條件是：28°C、初始pH為6. 8~7. 0、搖床轉(zhuǎn)速180 - 200r/min震蕩培養(yǎng)30h，制得 道地黃芪新菌株t21的發(fā)酵液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的道地黃芪固氮菌新菌株t21發(fā)酵液的制備方法，其特征在于， 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是由下列質(zhì)量/體積份的原料組成：YM液體培養(yǎng)基：甘露醇14份，酵母 粉 5 份，MgSO4 · 7H20 0· 1 份，K2HPO4 0· 3-0. 4 份，NaCl 0· 3-0. 4 份，CaCl2 0· 01 份，H2O 1000份，所配得的培養(yǎng)基pH 6. 8~7. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的道地黃芪固氮菌新菌株t21的使用的方法是：將含菌濃度為 IO8Inr1的發(fā)酵液浸種3h后播種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株道地黃芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21，于2014年9月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.9677。本發(fā)明詳細(xì)描述了道地黃芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21的形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)及16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果等。經(jīng)固氮試驗(yàn)表明，本發(fā)明道地黃芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21的發(fā)酵液對(duì)道地黃芪有較好的固氮作用，可以有效地為道地黃芪生長(zhǎng)提供天然氮源需要，從而對(duì)道地黃芪的天然品質(zhì)提供相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)來源。CGMCC No.967720140918
【IPC分類】C12R1-01, C12N1-20, C05F11-08
【公開號(hào)】CN104726365
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510024917
【發(fā)明人】唐中偉, 梁建萍, 周然, 薛智權(quán), 李 浩, 李倩
【申請(qǐng)人】山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 山西中醫(yī)學(xué)院
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年1月19日