一種熒光生物傳感器,其制備方法以及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于熒光傳感器領(lǐng)域，具體涉及構(gòu)建基于DNAzyme的催化作用和多次循環(huán)放大作用的無標(biāo)記的熒光生物傳感器及其對于DNA的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，對DNA的研宄是生命科學(xué)研宄中的一個極其重要的方面，DNA生物傳感器的研宄已成熱點。目前各種方式用于用于放大檢測信號從而提高檢測的靈敏度，而目前自催化的生物傳感器引起越來越多的關(guān)注，例如循環(huán)放大。由于多次循環(huán)擴(kuò)大大大提高了靈敏度而使其得到廣泛的應(yīng)用。然而現(xiàn)有技術(shù)中還沒有一種成熟有效的基于DNAzyme的催化作用和多次循環(huán)放大作用的無標(biāo)記的熒光生物傳感器及其制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種基于Tb3+/DNA的無標(biāo)記多次循環(huán)放大的熒光傳感器，其制備方法以及用途，利用[G3T]5可以敏華鋱發(fā)光的特性和多重循環(huán)擴(kuò)大檢測靈敏度構(gòu)建了熒光傳感器，應(yīng)用于目標(biāo)DNA的檢測。具體技術(shù)方案如下:
[0004]一種熒光生物傳感器的制備方法，進(jìn)一步地，包括如下步驟:
[0005](I)將DNA序列(SI:probe 1，S2:tDNA, S3:MB)溶解在PBS緩沖溶液中，保存?zhèn)溆茫?br>[0006](2)對所用物質(zhì)配置成相應(yīng)的濃度；
[0007](3)將S1，S2和S3放在容器中，培養(yǎng)，利用DNA之間的堿基互補配對作用使S2打開SI環(huán)形成雙鏈；
[0008](4)加入 Exo III ；
[0009](5)加入 Zn2+溶液；
[0010](6)通過沉淀分離得到修飾了四氧化三鐵的單鏈DNA，并將DNA加入到含有MB2的溶液中，再加入Exo III ；
[0011](7)加入 Tb3+溶液。
[0012]進(jìn)一步地，步驟⑴中，PBS緩沖溶液pH 7.4，在低溫下保存?zhèn)溆?；?或，使用之前將SI，S3于80-90°C加熱10分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間。
[0013]進(jìn)一步地，步驟(2)中，所用物質(zhì)為ZnCl2, Tb203。
[0014]進(jìn)一步地，步驟(3)中，將處理過的SI，S2和S3放在容器中，在37°C培養(yǎng)30min。
[0015]進(jìn)一步地，步驟(4)中包括如下步驟:
[0016](4-1)加入Exo III去切割形成的雙鏈的3端；
[0017](4-2)培養(yǎng) 30min，釋放大量的 tDNA 和 DNAzyme ；
[0018](4-3)加熱至 85°C培養(yǎng) 15min 使 Exo III 失活；
[0019](4-4)培養(yǎng)30min使更多釋放的DNAzyme可以結(jié)合到S3 (MB)上。
[0020]進(jìn)一步地，步驟(5)中，將Zn2+溶液加入到前述溶液中，培養(yǎng)40min。
[0021]進(jìn)一步地，步驟(6)中，將DNA加入到含有MB2的溶液中進(jìn)行互補配對，再加入ExoIII去切割形成的雙鏈的3端，培養(yǎng)30min，釋放大量的tDNA和DNAzyme，之后加熱至85°C培養(yǎng)15min使Exo III失活，而后釋放大量的[G3T]5。
[0022]進(jìn)一步地，步驟(7)中，將Tb3+溶液加入到上述溶液中，培養(yǎng)lOmin。
[0023]一種熒光生物傳感器，采用上述方法制備得到。
[0024]上述熒光生物傳感器的用途，用于對目標(biāo)DNA的檢測。
[0025]與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了基于Tb3+/DNA的無標(biāo)記多次循環(huán)放大的熒光傳感器及其應(yīng)用于目標(biāo)DNA的檢測，本發(fā)明使用[G3T]5可以敏華鋱發(fā)光的特性，利用多次循環(huán)擴(kuò)大檢測靈敏度，制備出基于Tb3+/DNA的無標(biāo)記多次循環(huán)放大的熒光傳感器，利用[63115可以敏華鋱發(fā)光的特性，此傳感器實現(xiàn)了對目標(biāo)DNA靈敏性、特異性的檢測。本熒光傳感器的制備方法，使用的是無標(biāo)記的DNA，操作簡單，成本很低，避免任何化學(xué)標(biāo)記和修飾。結(jié)果顯示此傳感器對tDNA的檢測結(jié)果令人滿意，約從20到400aM有較靈敏的檢測，且具有操作簡單，靈敏度高，檢測限低的特點。
【附圖說明】
[0026]圖1A為[G3T] 5敏華鋱發(fā)光的性質(zhì)圖；
[0027]圖1B為[G3T]5敏華鋱發(fā)光的紫外吸收光譜；
[0028]圖1C Tb3+熒光壽命的考察；
[0029]a在不存在[G3T] 5情況下Tb 3+的熒光壽命；
[0030]b在存在下Tb3+的熒光壽命；
[0031]圖2各種物質(zhì)存在條件下的熒光光譜圖；
[0032]圖3基于Tb3+/DNA傳感器的選擇性考察；
[0033]圖4A為基于Tb3+/DNA傳感器無標(biāo)記檢測不同濃度tDNA對應(yīng)熒光光譜；
[0034]圖4B為熒光強度與不同tDNA濃度間的關(guān)系；
[0035]圖4C熒光強度與不同tDNA濃度對數(shù)間線性關(guān)系；
[0036]圖5為基于Tb3+/DNA的無標(biāo)記多次循環(huán)放大的熒光傳感器檢測tDNA的示意圖。
【具體實施方式】
[0037]下面根據(jù)附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，其為本發(fā)明多種實施方式中的一種優(yōu)選實施例。
[0038]一種基于Tb3+/DNA的無標(biāo)記多次循環(huán)放大的熒光傳感器制備方法，包括如下步驟:
[0039](I)將購買的 DNA 序列(SI:probe 1，S2:tDNA, S3:MB)溶解在 PBS(pH 7.4)緩沖溶液中，并在低溫下下保存?zhèn)溆?，使用之前將S1，S3于80-90°C加熱10分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間。
[0040](2)對所用的物質(zhì)如ZnCl2, Tb2O3配置成相應(yīng)的濃度；
[0041](3)將處理過得SI，S2和S3放在容器中，在37°C培養(yǎng)30min，利用DNA之間的堿基互補配對作用是S2打開SI環(huán)形成雙鏈。
[0042](4)再加入Exo III去切割形成的雙鏈的3端，培養(yǎng)30min，釋放大量的tDNA和DNAzyme0之后加熱至85°C培養(yǎng)15min使Exo II I失活。而后在培養(yǎng)30min使更多釋放的DNAzyme可以結(jié)合到S3 (MB)上。
[0043](5)最后將Zn2+溶液加入到上述溶液中，培養(yǎng)40min。
[0044](6)通過沉淀分離得到修飾了四氧化三鐵的單鏈DNA，并將DNA加入到含有MB2的溶液中，進(jìn)行互補配對，再加入Exo III去切割形成的雙鏈的3端，培養(yǎng)30min，釋放大量的tDNA和DNAzyme。之后加熱至85°C培養(yǎng)15min使Exo III失活。而后釋放大量的[G3T]5。
[0045](7)最后將Tb3+溶液加入到上述溶液中，培養(yǎng)lOmin。
[0046](8) tDNA的濃度不同，鏈交換反應(yīng)所產(chǎn)生的DNAzyme的量不同，切割的MB機(jī)制的量不同，釋放的[G3T]5的量也不同。隨著tDNA濃度的增加，Tb3+的熒光強度會逐漸增強。因此此傳感器可對不同濃度的tDNA進(jìn)行定量檢測。
[0047]上面結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將DNA序列(SI:probe 1，S2:tDNA，S3:MB)溶解在PBS緩沖溶液中，保存?zhèn)溆茫? (2)對所用物質(zhì)配置成相應(yīng)的濃度； (3)將S1，S2和S3放在容器中，培養(yǎng)，利用DNA之間的堿基互補配對作用使S2打開SI環(huán)形成雙鏈；(4)加入Exo III ； (5)加入Zn2+溶液； (6)通過沉淀分離得到修飾了四氧化三鐵的單鏈DNA，并將DNA加入到含有MB2的溶液中，再加入Exo III ； (7)加入Tb3+溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，PBS緩沖溶液pH 7.4，在低溫下保存?zhèn)溆?；?或，使用之前將31，33于80-90°0加熱10分鐘后自然冷卻到室溫培養(yǎng)一段時間。
3.如權(quán)利要求1或2所述的熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所用物質(zhì)為ZnCl2, Tb2O3O
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，將處理過的SI，S2和S3放在容器中，在37°C培養(yǎng)30min。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(4)中包括如下步驟: (4-1)加入Exo III去切割形成的雙鏈的3端； (4-2)培養(yǎng)30min，釋放大量的tDNA和DNAzyme ； (4-3)加熱至85°C培養(yǎng)15min使Exo III失活； (4-4)培養(yǎng)30min使更多釋放的DNAzyme可以結(jié)合到S3 (MB)上。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，將Zn2+溶液加入到前述溶液中，培養(yǎng)40min。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(6)中，將DNA加入到含有MB2的溶液中進(jìn)行互補配對，再加入Exo III去切割形成的雙鏈的3端，培養(yǎng)30min，釋放大量的tDNA和DNAzyme，之后加熱至85°C培養(yǎng)15min使Exo III失活，而后釋放大量的[G3T] 5。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(7)中，將Tb3+溶液加入到上述溶液中，培養(yǎng)1min。
9.一種熒光生物傳感器，其特征在于，采用如權(quán)利要求1-8所述方法制備得到。
10.如權(quán)利要求9所述熒光生物傳感器的用途，其特征在于，用于對目標(biāo)DNA的檢測。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熒光生物傳感器，其制備方法以及用途，具體涉及Tb3+/DNA的無標(biāo)記多次循環(huán)放大的熒光傳感器，利用使用[G3T]5可以敏華鋱發(fā)光的特性和多次循環(huán)擴(kuò)大檢測靈敏度，應(yīng)用于目標(biāo)DNA的檢測。包括如下步驟：(1)將DNA序列(S1：probe 1，S2：tDNA，S3:MB)溶解在PBS緩沖溶液中，保存?zhèn)溆茫?2)對所用物質(zhì)配置成相應(yīng)的濃度；(3)將S1，S2和S3放在容器中，培養(yǎng)，利用DNA之間的堿基互補配對作用使S2打開S1環(huán)形成雙鏈；(4)加入Exo III；(5)加入Zn2+溶液；(6)通過沉淀分離得到修飾了四氧化三鐵的單鏈DNA，并將DNA加入到含有MB2的溶液中,再加入Exo III；(7)加入Tb3+溶液。此傳感器實現(xiàn)了對目標(biāo)DNA靈敏性、特異性的檢測。本熒光傳感器的制備方法，使用的是無標(biāo)記的DNA,操作簡單，成本很低，避免任何化學(xué)標(biāo)記和修飾。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104726610
【申請?zhí)枴緾N201510179272
【發(fā)明人】王廣鳳, 江紅
【申請人】安徽師范大學(xué)
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年4月15日