一種新型耐熱糖苷水解酶MtCel3及其編碼序列和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程，具體地說(shuō)是一種以嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila糖苷水解酶基因MtCel3表達(dá)的高效耐熱糖苷水解酶MtCel3及其編碼序列和 應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 糖苷水解酶（英語(yǔ)：Glycoside hydrolases，又稱(chēng)糖苷酶）是一種專(zhuān)門(mén)水解配糖鍵 (glycosidic bond)，并產(chǎn)生兩個(gè)較小的糖分子的酵素，也是自然界中的常見(jiàn)酵素之一。這 類(lèi)蛋白質(zhì)在人類(lèi)的產(chǎn)業(yè)上也有所應(yīng)用，例如用來(lái)將纖維素與半纖維素等生物質(zhì)能降解成可 用的小分子。糖苷水解酶具有多個(gè)家族。
[0003] 嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。 該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中50°C條件下可以產(chǎn)生熱穩(wěn)定的纖維素酶和糖苷 水解酶。
[0004] 嗜熱毀絲菌產(chǎn)生的耐熱糖苷水解酶MtCel3具有很強(qiáng)的纖維素酶活性，可有效地 把長(zhǎng)鏈纖維素分解為寡糖，目前為止尚未有關(guān)于此酶的任何報(bào)道。MtCel3對(duì)羧甲基纖維素 的水解活力尚達(dá)47. 5 lU/mg，具有很尚的纖維素水解能力。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明從嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila獲得DUF4360超家族耐熱糖 苷水解酶基因的cDNA序列全長(zhǎng)，命名為MtCel3,基因cDNA全長(zhǎng)627bp，編碼208個(gè)氨基酸。 MtCel3具有信號(hào)肽序列（l-17aa MRLQALTLSLLAAAGLA)及2個(gè)N糖基化位點(diǎn)和3個(gè)0糖基 化位點(diǎn)。將MtCel3編碼的氨基酸序列在國(guó)際基因庫(kù)中進(jìn)行檢索，尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。
[0006] 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pPIC9K/MtCel3,利用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115,在MD和麗培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，G418篩選多拷貝 轉(zhuǎn)化子，然后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，獲得畢赤酵母工程菌株GS-MT-Cel3。該工程菌株接種于 含BMGY培養(yǎng)基中，在28°C 200rpm/min搖床培養(yǎng)6d后，糖苷水解酶的表達(dá)量為3. 8mg/ml， 分子量為27. 2KDa，對(duì)羧甲基纖維素的水解活力高達(dá)47. 51U/mg，對(duì)微晶纖維素的水解活力 為4. 33U/mg，MtCel3在60°C下是穩(wěn)定的，處理lh后仍有95%以上的酶活性；70°C處理lh 后仍保持78%的活性；80°C處理lh后保持25%的活性；90°C處理lh后保持8%。
[0007] 耐熱糖苷水解酶MtCel3對(duì)長(zhǎng)鏈纖維素具有很強(qiáng)的水解能力，其對(duì)羧甲基纖維素 的水解活力高達(dá)47. 51U/mg，對(duì)微晶纖維素的水解活力為4. 33U/mg，對(duì)脫脂棉的水解活性 為12. 21U/mg，對(duì)濾紙的水解活性為8. 82U/mg。并且MtCel3有很好的熱穩(wěn)定性，在70°C的 處理lh條件下仍可以保持78%的活性，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。 (四）
【附圖說(shuō)明】
[0008] 圖1耐熱糖苷水解酶MtCel3的SDS-PAGE分析
[0009] 泳道1 :低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)
[0010] 泳道2 :純化的耐熱糖苷水解酶MtCel3 [0011]圖2A:耐熱糖苷水解酶MtCel3的最適溫度
[0012] B:耐熱糖苷水解酶MtCel3的熱穩(wěn)定性測(cè)定
[0013] 圖3耐熱糖苷水解酶MtCel3的最適pH
[0014] 圖4耐熱糖苷水解酶MtCe 13水解羧甲基纖維素產(chǎn)物的TLC分析
[0015] 泳道1 :標(biāo)準(zhǔn)寡糖（DP2-DP7)
[0016] 泳道2:水解羧甲基產(chǎn)物 (五）【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1 :嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila的分離鑒定
[0018] (1)標(biāo)本采集：從堆肥中采集。
[0019](2)分離培養(yǎng)：將采集標(biāo)本取0. 5克放置在PDA平板上50°C培養(yǎng)3天后，進(jìn)行分離 純化。操作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻(xiàn)。
[0020] (3)鑒定：參考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文獻(xiàn)。
[0021] 實(shí)施例2 :耐熱糖苷水解酶基因MtCel3的克隆
[0022](1)嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila總 RNA 的提取：參照Trizol試劑 盒說(shuō)明。
[0023] (2) cDNA 第一條鏈的合成：按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. 0 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：取1~2 y g總RNA，加RNase Free ddH20至9. 5 y L，將RNA樣品在75°C 變性5 m i n，立即在冰浴中冷卻5 m i n，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成 分：10mmol/L dNTP Mixture 2yL，10XRT BufTer(Mg2+)2yL，25mmol/L MgCl24yL，Oligo d (T)-Adaptor Primer 1 y L, RNase Inhibiter 0.5 y L, AMV Reverse Transcriptase 1 y L(Final Volume 20 y L)，將反應(yīng)液混合后，室溫下放10min，然后42°C溫育60min，再煮 沸5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。加入180 y L DEPC處理的ddH20,稀釋至200 y L，混勾，稍微離心， 保存于-20 °C，備用。
[0024] (3)PCR反應(yīng)（25yL) :cDNA 2yL，lOXBuffer 2. 5yL，10mmol/L dNTP2yL， 25臟〇1/11%(：1221^，上、下游引物各21^，了39〇嫩聚合酶0.5 1^(5。/1^)，(1(1112012 1^。 反應(yīng)條件為94°C 5min預(yù)變性；94°C 40s，52°C 40s，72°C lmin，共32個(gè)循環(huán)，72°C延伸 10min，4°C保存。
[0025] 上游引物：5 ' -ATGAGACTCCAAGCCCTGAC-3 '
[0026] 下游引物：5 ' -CTACTCATCCITTGCGATCAC-3 '
[0027] (4)基因克?。喝?.5ylPCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，操作步驟按照 TAKARA公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，在表面涂有氨卞青 霉素（100 Ug/mL)的LB平板上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。
[0028] (5)質(zhì)粒DNA的提?。簤A法提取質(zhì)粒DNA。
[0029] (6)序列測(cè)定：DNA雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進(jìn)行。序 列引物為M13啟動(dòng)子引物。嗜熱毀絲菌MtCel3基因cDNA全長(zhǎng)627bp，包含起始密碼子和終 止密碼子，無(wú)內(nèi)含子，編碼208個(gè)氨基酸。將此氨基酸序列在國(guó)際基因庫(kù)中進(jìn)行檢索，尚未 發(fā)現(xiàn)報(bào)道。該序列如下：
[0030] (A)SEQ ID NO 1 的信息
[0031] (a)序列特征：*長(zhǎng)度：627堿基對(duì)；*類(lèi)型：核酸；*鏈型：雙鏈；*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線(xiàn)性
[0032] (b)分子類(lèi)型：DNA
[0033] (c)假設(shè)：否
[0034] ⑷反義：否
[0035] (e)最初來(lái)源：嗜熱毀絲菌 Myceliophthora thermophila
[0036] (f)序列描述：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新型嗜熱毀絲菌（Myceliophthorathermo地ila)糖巧水解酶化Cel3及其編 碼序列和應(yīng)用，其特征是該水解酶是一種尚未報(bào)道的熱穩(wěn)定內(nèi)切糖巧水解酶，具有良好的 纖維素酶活性。通過(guò)RT-PCR方法從嗜熱毀絲菌獲得糖巧水解酶基因MtCel3,將該基因克 隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體PPIC9K，獲得表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9K/MtCel3,轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115,從中篩選出表達(dá)熱穩(wěn)定糖巧水解酶基因化Cel3的畢赤酵母工程菌株GS-MT-Cel3， 其表達(dá)產(chǎn)生的糖巧水解酶化Cel3對(duì)纖維素具有很高的內(nèi)切水解酶活性；其中，所述嗜熱毀 絲菌糖巧水解酶化Cel3核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。 注意事項(xiàng) 一、 申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)巧或者實(shí)用新型專(zhuān)利應(yīng)當(dāng)提交權(quán)利要求書(shū)，一式一份。 二、權(quán)利要求書(shū)應(yīng)當(dāng)打宇或者印刷，字跡應(yīng)當(dāng)整齊清晰，呈黑色，符合制版要求，不得涂改，字高應(yīng)當(dāng)在 3. 5毫米至4. 5毫米么間，巧距應(yīng)當(dāng)在2. 5毫米至3. 5毫米之間，權(quán)利要求書(shū)首頁(yè)用此頁(yè)，續(xù)頁(yè)可使 用同樣大小和質(zhì)量相當(dāng)?shù)陌准?。紙張?yīng)當(dāng)繳向使用，只限使用正面，四周應(yīng)當(dāng)留有頁(yè)邊距：左側(cè)和頂 部各巧毫米，右側(cè)和底部各15毫米。 S、權(quán)利要求書(shū)應(yīng)當(dāng)說(shuō)明發(fā)明或者實(shí)用新型的技術(shù)特征，清楚和簡(jiǎn)要地表述請(qǐng)求保護(hù)的范圍。權(quán)利要求書(shū) 有幾項(xiàng)權(quán)剎要求時(shí)，應(yīng)當(dāng)用阿拉化數(shù)字順序編號(hào).菊號(hào)前不得冠W"權(quán)利要求"或者"權(quán)項(xiàng)"等詞。 四、 權(quán)利要求書(shū)中使用的科技術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)與說(shuō)明書(shū)中使用的一致，可W有化學(xué)式或者數(shù)學(xué)式，必要時(shí)可W有 表格，但不得有插圖。不得使用"如說(shuō)明書(shū)……部分巧述"或者"如圖……巧示"等用語(yǔ)。 五、 每一碩權(quán)利度求僅允許在權(quán)利巧求的結(jié)展化使用句號(hào)。 六、 權(quán)不0要求書(shū)應(yīng)當(dāng)巧毎頁(yè)下框線(xiàn)居中位置順序編寫(xiě)頁(yè)碼。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明是一種新型熱穩(wěn)定的嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila糖苷水解酶MtCel3及其編碼序列和應(yīng)用。通過(guò)RT-PCR方法從嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila中獲得糖苷水解酶基因MtCel3，將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達(dá)載體pPIC9K中，然后將得到的糖苷水解酶基因MtCel3表達(dá)載體pPIC9K/MtCel3導(dǎo)入到畢赤酵母GS115中，再?gòu)闹泻Y選出一種表達(dá)糖苷水解酶基因MtCel3的酵母工程菌GS-MT-Cel3其表達(dá)產(chǎn)生的糖苷水解酶MtCel3對(duì)纖維素具有很高的內(nèi)切水解酶活性。MtCel3具有良好的熱穩(wěn)定性和很強(qiáng)的水解纖維素能力，可廣泛用于纖維廢料及其它工業(yè)領(lǐng)域，具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。
【IPC分類(lèi)】C12N15-81, C12N15-56, C12N9-42, C12R1-84
【公開(kāi)號(hào)】CN104789580
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510222269
【發(fā)明人】李多川, 韓超, 陳宸
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年5月5日