循環(huán)腫瘤dna egfr檢測(cè)技術(shù)及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)及其試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)是人表皮生長(zhǎng)因子受體（HER)家族成員，屬于受體酪氨 酸激酶家族，是原癌基因c-erbBl的表達(dá)產(chǎn)物。EGFR主要位于細(xì)胞膜，被EGF等配體激活后 發(fā)生二聚化并引發(fā)細(xì)胞內(nèi)段磷酸化，產(chǎn)生酪氨酸激酶活性，進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路（Pao W et al.Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101:13306-11)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等多種生 理過程。EGFR下游信號(hào)通路主要有：Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK通路、PI3K/roKl/Akt通路、 PLC-y 通路、JAK/STAT 通路等（Sun J M et al. Lung Cancer. 2010;68:427-32)。
[0003] 許多實(shí)體瘤均存在EGFR信號(hào)通路相關(guān)基因體細(xì)胞突變或表達(dá)異常，與腫瘤生長(zhǎng)、 侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EGFR信號(hào)通路重要靶標(biāo)的檢測(cè)及靶向治療一直是國(guó)際腫瘤個(gè)體化醫(yī) 療領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。
[0004] 基于EGFR在腫瘤細(xì)胞中異常的特點(diǎn)，目前已開發(fā)出多種EGFR靶向藥物。比如作 用于EGFR激酶區(qū)的小分子酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI)，如吉非替尼（Gefitinib)、厄洛 替尼（Erlotinib)和?？颂婺幔↖cotinib);作用于EGFR胞外域部分的單克隆抗體，如西妥 昔單抗（Cetuximab)、帕尼單抗（Vectibix)。
[0005] 常用的EGFR-TKI包括吉非替尼、厄洛替尼和?？颂婺?，是目前非小細(xì)胞肺癌患 者最有效的靶向藥物。但是，EGFR-TKI并非對(duì)所有的患者都有效。EGFR外顯子18、19、21 發(fā)生突變的患者、吉非替尼有效率可達(dá)80%，而野生型患者基本無效。EGFR突變是藥物 有效性的前提（Sequist L V et al.J Clin Oncol. 2008;26:2442-9, Yang C H et al.J Clin Oncol. 2008 ；26:2745-53, Suda K et al. J Thorac Oncol. 2009 ；4:1-4, Costa D B et al, Clin Cancer Res. 2008;14:7060-7)。但部分EGFR-TKI初始有效的患者后期會(huì)發(fā)生耐 藥、與EGFR外顯子20發(fā)生突變密切相關(guān)。以非小細(xì)胞肺癌為例，EGFR外顯子20突變發(fā)生 率為1. 6%，約占EGFR突變率的9%，50%的EGFR-TKI耐藥由EGFR外顯子20的p. I790M 點(diǎn)突變所致（Suda K et al.J Thorac Oncol. 2009 ;4:1-4, Costa D B et al, Clin Cancer Res. 2008 ； 14:7060-7, Gazdar A F. Oncogene. 2009 ；28Suppl l:S24-31.)〇
[0006] EGFR 突變和 EGFR-TKI 的治療效果密切相關(guān)（Sequist L V et al.J Clin Oncol. 2008；26:2442-9, Yang C H et al.J Clin Oncol. 2008 ；26:2745-53, Suda K et al.J Thorac Oncol. 2009；4:1-4, Costa D B et al,Clin Cancer Res. 2008； 14:7060-7,Gazdar A F.0ncogene.2009;28Suppl 1:S24-31.)，因此，EGFR 的突變檢測(cè)對(duì) 于癌癥的EGFR-TKI個(gè)體化治療具有重要的意義。目前常用的EGFR突變檢測(cè)有測(cè)序法、 PCR-SSCP、ARMS、數(shù)字 PCR 以及 NGS 等。
[0007] 目前，EGFR突變檢測(cè)都是基于腫瘤組織樣本的，這樣存在兩個(gè)問題，一，腫瘤組織 大都來源于活檢技術(shù)即穿刺和活檢鉗活檢，這樣會(huì)給病人帶來極大的痛苦，是有創(chuàng)檢測(cè)。 二，對(duì)于某些晚期的病人，不能穿刺或者手術(shù)，病人樣本就很難獲取，因此就很難根據(jù)檢測(cè) 的結(jié)果對(duì)病人進(jìn)行靶向用藥。臨床上迫切需要一種能夠替代腫瘤組織的樣本來對(duì)病人進(jìn)行 個(gè)性化指導(dǎo)用藥。
[0008] 循環(huán)腫瘤DNA是指腫瘤患者外周血循環(huán)中存在較高水平的DNA。浸潤(rùn)性腫瘤患者 外周血中DNA含量更高。這些DNA來源于腫瘤細(xì)胞，具有和腫瘤組織DNA擁有相似的遺傳 學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移存在很大的關(guān)系，因此表現(xiàn)出其對(duì)腫瘤的 早期診斷、鑒別、分期、預(yù)后和治療檢測(cè)方面具有重要意義（Bettegowda C et al.2014Sci. Transl Med 224:224ra24)〇
[0009] 循環(huán)腫瘤DNA雖然是一種很好的腫瘤組織替代樣本，但是，由于循環(huán)腫瘤DNA含 量稀少，檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA需要極靈敏的技術(shù)。BEAMing擴(kuò)增法的應(yīng)用使得DNA檢測(cè)技術(shù) 靈敏度大大提高。2007年，該技術(shù)的開發(fā)者美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)的Bert Vogelstein和 Kenneth Kinzler對(duì)18名結(jié)直腸癌患者的循環(huán)腫瘤DNA進(jìn)行了跟蹤。研宄顯示，術(shù)后仍 能檢測(cè)到循環(huán)腫瘤DNA的患者，基本上都出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，術(shù)后未檢測(cè)到循環(huán)腫瘤DNA的患者， 結(jié)直腸癌無復(fù)發(fā)，顯示了循環(huán)腫瘤DNA良好地臨床應(yīng)用前景（Luis A et al.2012Nature 7404:537-540)。BEAMing技術(shù)的靈敏度高，可以達(dá)到0. 1% -0. 01%，是一種比較理想的循 環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)技術(shù)（Frank D et al 2006Nature Method 551-559)。但是由于其操作 復(fù)雜，儀器昂貴，不適用于大規(guī)模臨床推廣。數(shù)字PCR是近年來出現(xiàn)的另一種高靈敏度檢 測(cè)的技術(shù)，這種技術(shù)最高也能達(dá)到〇. 01 %的靈敏度，但是這種技術(shù)極易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果 (Pinheiro LB et al.2012Anal Chem;84(2):1003 - 1011)。同樣，高昂的設(shè)備和試劑價(jià)格、 極高的實(shí)驗(yàn)操作要求也同樣限制了其大規(guī)模推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的：提供一種循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)及其試劑盒，靈敏度極高， 平均達(dá)到0. 1 % -0. 01 %的水平，特別適合檢測(cè)稀有突變；利用此稀有突變的檢測(cè)方法，檢 測(cè)循環(huán)腫瘤DNA中EGFR的突變，并形成試劑盒，為廣大的腫瘤患者服務(wù)。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0012] 一種循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，包括如下步驟：
[0013] 步驟1 :針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成引物、封閉探針和檢測(cè)探針。
[0014] 步驟2 :樣本處理與DNA的提取。
[0015] 步驟3 :所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于試劑盒中，建立PCR擴(kuò)增反應(yīng) 體系。
[0016] 上述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，其中，在所述的步驟2中，提取的所述的樣本 適用于病人血漿中的循環(huán)腫瘤DNA或石蠟切片組織。
[0017] 上述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，其中，在所述的步驟3中，所述的PCR擴(kuò)增反 應(yīng)體系包括：
[0018]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，其特征在于：包括如下步驟： 步驟1 :針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成引物、封閉探針和檢測(cè)探針； 步驟2 :樣本處理與DNA的提??； 步驟3 :所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于試劑盒中，建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，其特征在于：在所述的步驟2 中，提取的所述的樣本適用于病人血漿中的循環(huán)腫瘤DNA或石蠟切片組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，其特征在于：在所述的步驟3 中，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括： IOXPCRBuffer 稀釋為IX 模板 2uL 各引物 200-400 nM 各探針 100-400 nM 各封閉探針 200-400 nM 熱啟動(dòng)Taq酶 IU dNTP 0. 5mM MgCL2 2-5mM 總體積 20uL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，其特征在于：在所述的步驟I 中，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：循環(huán)數(shù)為1，溫度為95°C，反應(yīng)時(shí)間為10分鐘。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，其特征在于：在所述的步驟2 中，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：循環(huán)數(shù)為2,溫度為95°C，反應(yīng)時(shí)間為15秒鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，其特征在于：在所述的步驟2 中，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：循環(huán)數(shù)為2,溫度為62°C，反應(yīng)時(shí)間為45秒鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，其特征在于：在所述的步驟3 中，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：循環(huán)數(shù)為40,溫度為95°C，反應(yīng)時(shí)間為10秒 鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)，其特征在于：在所述的步驟3 中，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：循環(huán)數(shù)為40,溫度為60°C，反應(yīng)時(shí)間為1分鐘。
9. 一種利用權(quán)利要求1-8所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，其特 征在于：通過所述的試劑盒提取循環(huán)腫瘤的DNA樣本。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)及其試劑盒，包括如下步驟：步驟1：針對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成引物、封閉探針和檢測(cè)探針。步驟2：樣本處理與DNA的提取。步驟3：所述的循環(huán)腫瘤DNA EGFR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于試劑盒中，建立PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。本發(fā)明采用了特異的MGB Blocker探針，EGFR特異探針和引物，可以檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA中EGFR的突變；利用MGB Blocker阻滯了EGFR野生型基因組非特異性的擴(kuò)增，提高了其靈敏度；可以在循環(huán)腫瘤DNA中檢測(cè)EGFR的突變；操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)廉價(jià)，可以大規(guī)模推廣；檢測(cè)速度快，檢測(cè)過程大約需要2小時(shí)就可完成。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104789677
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510187617
【發(fā)明人】張道允, 鞏子英
【申請(qǐng)人】上海允英醫(yī)療科技有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月20日